高效液相色谱法测定人血液、尿液中的2，4-D丁酯

刘晓敏，廖林川，颜有仪，杨林，盛欣，钟应佳

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041；2.四川大学华西药学院，四川成都610041）

高效液相色谱法测定人血液、尿液中的2，4-D丁酯

刘晓敏1，廖林川1，颜有仪1，杨林1，盛欣2，钟应佳1

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041；2.四川大学华西药学院，四川成都610041）

目的建立检测血液、尿液中2，4-D丁酯的高效液相色谱分析方法。方法采用正己烷为样品萃取溶剂，色谱柱为Zorbax SB-Aq柱，流动相为V（甲醇）∶V（水）=60∶40。结果2，4-D丁酯在血液和尿液中的线性范围分别为0.10～10.00 μg/mL（r≥0.999 8）和0.08～8.00 μg/mL（r≥0.999 5），检测限分别为0.002 0 μg/mL和0.001 8 μg/mL，准确度为94.5%～104.5%，日内、日间精密度≤4.5%。结论本研究建立的血液、尿液中2，4-D丁酯的提取和HPLC检测方法，可应用于2，4-D丁酯中毒的快速检验和中毒死亡的法医学鉴定。

2，4-D丁酯；高效液相色谱法；法医毒物分析；生物样品

Abstract：Objective To establish a HPLC method for determination of 2，4-D butyl ester in blood and urine.Methods Compound was extracted from blood and urine using ethyl acetate.Separation was achieved on Zorbax SB-Aq column using methanolwater（60∶40）as mobile phase.Results The calibration curve of 2，4-D butyl ester ranged from 0.10 μg/mL to 10.00 μg/mL in blood（r≥0.999 8）and 0.08 μg/mL to 8.00 μg/mL in urine（r≥0.999 5），respectively.The limits of detection for the analyte was 0.002 0 μg/mL and 0.001 8 μg/mL in blood and urine，respectively.The intra and inter day assay precision were no more than 4.5%.The mean recovery ranged from 94.5%to 104.5%.Conclusions The pre-treatment and HPLC analysis of 2，4-D butyl ester in blood and urine can be used for rapid diagnosis of 2，4-D butyl ester poisoning and forensic identification of 2，4-D butyl ester poisoning death.

Key words：2，4-D butyl ester；HPLC；forensic toxicological analysis；biological specimen

2，4-D丁酯是一种苯氧羧酸类激素型选择性除草剂，具有较强内吸传导性、杀草谱广、除草效果好等特点，主要适用于小麦、玉米田中防除多种一年生阔叶杂草。2，4-D丁酯虽属于低毒类除草剂，但其中毒事件时有发生，尤其在农村地区多见。常见为口服中毒，其表现先为消化道症状，然后出现感觉异常、嗜睡、肌肉无力和肌纤维颤动，严重者出现抽搐、昏迷、大小便失禁和呼吸衰竭[1]。

目前对2，4-D丁酯的分析方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等，且多是对蔬菜、水果等食品中残留的2，4-D丁酯进行检测[2～4]。也有学者曾用家禽进行有关2，4-D丁酯的动物毒理学研究[5～7]，为了满足法医学毒物分析工作的需要，本研究尝试用高效液相色谱法分析生物样品中的该化合物，建立血液、尿液中2，4-D丁酯的高效液相色谱定性定量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；UV紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；BS210S电子分析天平（德国Sartorius公司），感量0.1 mg；LD422医用离心机（北京医用离心机厂）。

2，4-D丁酯对照品（100.00 μg/mL，1.0 mL）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（电阻率不小于18.2 MΩ.cm），其它试剂均为分析纯。

1.2 对照品溶液的配制

取2，4-D丁酯对照品（100.00 μg/mL）1.0 mL于容量瓶中，用正己烷精密定容至10.0 mL。配成质量浓度为10.00 μg/mL的对照品储备液，4℃下储存备用。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

量取血液（尿液）0.5 mL，涡旋混匀后，加入饱和氯化钠溶液0.5 mL，加入正己烷1.0 mL，涡旋5 min后，以离心半径6 cm，3000 rpm/min，离心5 min。取上层液体，以离心半径3 cm，12 000 rpm/min，高速离心10 min，取上清液进样分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为C18填料的短柱（8 mm×4 mm），流动相为V（甲醇）∶V（水）=（60∶40），流速为1 mL/min，柱温为25℃，检测波长为245 nm，同时收集190～360 nm的紫外吸收光谱，进样量为20 μL。

2 结果

2.1 专属性的考察

按“1.3.2”项色谱条件进样分析，2，4-D丁酯能得到很好地分离，血液和尿液中的内源性组分不干扰测定，2，4-D丁酯的保留时间约为7.8 min，理论板数＞6.4×103。其色谱图见图1。

图1 血液、尿液中2，4-D丁酯的色谱图

2.2 标准曲线的绘制

取0.5 mL空白血液或0.5 mL空白尿液数份，加入一定量不同质量浓度的2，4-D丁酯对照品，配成含系列质量浓度2，4-D丁酯的血液和尿液样品。血液中2，4-D丁酯质量浓度分别为0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL。尿液中2，4-D丁酯质量浓度分别为0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00 μg/mL。按“1.3.1”项进行处理后进样，记录峰面积。以2，4-D丁酯的峰面积（y）与其相应质量浓度（x）作线性回归，得2，4-D丁酯的回归方程，见表1。在所测质量浓度范围内，2，4-D丁酯在血液和尿液中的线性关系均良好（r≥0.999 5）。

2.3 检测限

配制质量浓度在标准曲线末端逐渐降低的系列生物样品，按“1.3.1”项进行前处理后进样，记录峰面积。以S/N≥3计，获得血液与尿液中2，4-D丁酯的检测限（表1）。

表1 血液、尿液中2，4-D丁酯的线性范围及检测限

2.4 精密度和准确度试验

取1.0 mL空白血液和1.0 mL空白尿液数份，添加2，4-D丁酯对照品，配成高、中、低3种质量浓度的血液和尿液样品，按“1.3.1”项进行前处理。每质量浓度的样品于一天内平行分析5次，得到日内精密度；于5日内分别重复测定3种质量浓度的样品，每日各平行测定3份，得到日间精密度；以测得的质量浓度除以实际添加的质量浓度，得方法回收率，即准确度，结果见表2。

表2 血液、尿液中2，4-D丁酯的准确度和精密度试验（n=5，%）

2.5 稳定性试验

配制数份含2，4-D丁酯高、中、低质量浓度的血液和尿液样品。考察样品在室温下放置2、8、12 h（见表3），反复冻融两次以及在-20℃下贮存5、10、20 d的稳定性。按“1.3.1”项进行样品的前处理后，进样分析。以测得的平均质量浓度对实际添加质量浓度的相对误差来衡量药物测定质量浓度的变化。结果表明，样品在室温下放置质量浓度变化≤15.1%，-20℃下贮存质量浓度变化≤13.5%，基本稳定。

表3 2，4-D丁酯在血液与尿液中的稳定性实验（n=5，μg/mL）

3 讨论

3.1 样品前处理

2，4-D丁酯生物样品前处理鲜有报道，有文献报道采取氯仿进行提取，并于70℃水浴氮气吹干[8]。本实验经考察萃取剂乙酸乙酯、乙醚、氯仿和正己烷，发现正己烷作为萃取溶剂的效果最好。乙酸乙酯、乙醚萃取回收率均低于正己烷（乙酸乙酯平均萃取回收率为61.85%，乙醚为58.74%，氯仿为70.45%，正己烷为80.55%）。因氯仿毒性较大，在尿液的提取中容易产生乳化现象且萃取效果不如正己烷，故将其排除在外。且采用正己烷提取生物检材的杂质较少。此外，本实验考察在浓缩时，比较水浴加空气流吹干，发现效果均不理想，这与2，4-D丁酯挥发性很强有关。综合考虑2，4-D丁酯极性较小，挥发性较强等性质问题，本实验选用同样极性较小的正己烷作萃取溶剂，不浓缩方式进样分析。于样品中加入0.5 mL饱和NaCl防止乳化现象的发生。

同时考察稳定性时，结果表明在室温条件下存放含2，4-D丁酯样品的稳定性略差（室温下放置质量浓度变化≤15.1%），这与2，4-D丁酯挥发性较强有关，因此在法医工作中，应注意检材的保存，并且应尽快处理检材。

3.2 定量方法的选择

本实验曾考虑用内标法对2，4-D丁酯进行定量，选择了与其结构相似、性质相近且2，4-D丁酯乳油中不会混有的药物-氯贝丁酯、贝诺酯等作为内标。但结果表明，采用内标法定量，其准确性与外标法所得结果差异无统计学意义。同时本实验样品预处理简单，用外标法显示样品多次测定的重现性好，各份样品的操作易平行一致。故本实验采取外标法进行定量，该方法简便可行，结果准确，可应用于生物样品中2，4-D丁酯的定量检测。

3.3 色谱条件的选择

以往对2，4-D丁酯的研究主要是应用气相色谱法、GC/MS方法检测，而采取高效液相色谱法对生物样品进行分析未见报道。本实验根据2，4-D丁酯的性质，采用甲醇-水系统，分别考察了V（甲醇）∶V（水）为80∶20、75∶25、70∶30、60∶40时的色谱行为。结果表明，以V（甲醇）∶V（水）=60∶40作为流动相时，内源性杂质不干扰测定，2，4-D丁酯保留时间也比较合适。

4 案例应用

文中所建2，4-D丁酯生物样品分析方法，已用于法医学毒物分析工作中。某女，56岁，某日发现死于自家卧室内，死因未明，搜索现场，发现家中有装2，4-D丁酯乳油的塑料空瓶。法医提取其心血送检，采用所建方法进行检测，死者心血中检出2，4-D丁酯质量浓度为7.9 μg/mL。

5 结论

本实验所建方法简便、快速、成本低，且准确、灵敏、重复性好，适用于2，4-D丁酯中毒的快速检验诊断和中毒死亡的法医学鉴定工作。

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（本文编辑：卓先义）

Determination of 2，4-D Butyl Ester in Blood and Urine by HPLC

LIU Xiao-min1，LIAO Lin-chuan1，YAN You-yi1，YANG Lin1，SHENG Xin2，ZHONG Ying-jia1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.01.005

1671-2072-（2011）01-0023-03

2010-07-23

刘晓敏（1984-），女，硕士研究生。

廖林川，教授，主要从事法医毒物（药物）分析研究。E-mail：linchuanliao@163.com。