甲醛溶液固定对ICP-MS检测电流损伤皮肤金属化的影响

张建华，陈圆圆，2，马栋，李立，3，陈忆九

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州215123；3.复旦大学上海医学院法医学系，上海200032）

甲醛溶液固定对ICP-MS检测电流损伤皮肤金属化的影响

张建华1，陈圆圆1，2，马栋1，李立1，3，陈忆九1

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州215123；3.复旦大学上海医学院法医学系，上海200032）

目的探讨应用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry ICP-MS）技术检测甲醛溶液固定后电流损伤皮肤中金属元素。方法利用黄铜、铁电极材料以220V交流电电击兔子后肢，电损伤皮肤分别进行甲醛溶液固定1周、6个月后，应用ICP-MS对电流损伤皮肤中金属元素进行测定。结果与对照组皮肤比较，黄铜电击组皮肤中检测出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb含量升高（P＜0.05）；固定1周、6个月后仍可检测出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量电击组与固定组差异无统计学意义。与对照组比较，铁电击后皮肤中检测出Fe、Cr、Mn、Ni元素含量升高（P＜0.05）；固定组（1周和6个月）后Fe、Cr、Ni元素含量与电击组差异无统计学意义。结论ICP-MS可作为检测电流损伤皮肤中金属元素的有效方法，甲醛溶液固定后触电皮肤仍可进行沉积的金属元素检测，且固定对皮肤金属元素的含量影响较小，该方法仍可为电流损伤诊断提供依据。

法医病理学；电击伤；皮肤；电感耦合等离子体质谱仪；甲醛溶液；金属化；兔

Abstract：Objective To detect metal elements in skin in electric injury by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICPMS）after fixed by formalin.Methods Brass and iron were used as electrodes to make electrical marks on rabbit hind limbs（220v AC），and the injured skin was fixed in formalin for 1 week or 6 months separately.ICP-MS was applied to detect metal elements in the injured skin.Results Compared with the control group，the levels of chromium，nickel，copper，zinc and lead were higher in the group of brass shock，and these elements were still detected in the injured skin fixed for 1 week or 6 months by formalin.Furthermore，the chromium，copper，zinc and lead concentrations showed no significant difference between the instant injured group and the fixed group.Compared with the control group，the levels of chromium，manganese and nickel were higher in the group of iron shock.Iron，chromium and nickel concentrations showed no significant difference between the instant injured group and the fixed group.Conclusion ICP-MS can be used as an effective tool to detect electric injury.After formalin fixation for as long as 6 months，deposited metal elements can still be detected in the injured skin and the fixation showed little effect on the levels of metal elements in the skin.Therefore，formalin fixed skin can provide evidence for electric injuries.

Key words：forensic pathology；electric injury；skin；inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）；formalin；metallization；rabbit

日常检案中对电流损伤的诊断主要依靠组织学检查，如皮肤电流斑；此外，皮肤金属化对电流损伤的诊断有很高价值[1]，可作为电流损伤皮肤的特异性诊断指标，而且检测电流损伤皮肤中金属元素的组成和含量可以推断电极的来源[2]。然而，在实际检案工作中，触电皮肤多经过甲醛溶液固定处理，这为电击皮肤中金属元素的检测带来问题。本研究应用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测甲醛溶液固定前、后皮肤金属元素的含量变化，进一步判断甲醛溶液固定对电击后皮肤中金属元素的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

10%甲醛溶液固定液（0.01mmol/L PBS稀释）。65%硝酸（优级纯，德国Merck公司），ICP-MS调谐溶液（6Li、89Y、205Tl，质量浓度均为1μg/L，美国Agilent公司），内标储备液（115In，质量浓度10 mg/L，美国Agilent公司），混合标准储备液（Al、Fe质量浓度为1 000mg/L，Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn质量浓度均为10 mg/L，美国Agilent公司），去离子水（18.2 MΩ.cm，由Millipore超纯水处理系统制得）。脱毛剂（8%硫化钠溶液）、麻醉剂（3%戊巴比妥钠）。

1.2 仪器

7500Ce电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司），MWS-3+微波消解仪（德国Berghof公司），Element A10超纯水处理系统（美国Millipore公司），DHP-9082型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。自制实验电击设备（可调节电压和控制触电时间），自制黄铜、铁电极片（大小约0.8cm×0.8cm），电子天平（德国赛多利邦公司）。

1.3 实验动物分组及动物模型制备

健康清洁级新西兰大白兔32只，雌雄不分，体质量（2±0.3）kg（复旦大学上海医学院动物饲养中心提供）。随机分为黄铜电击组、铁电击组，每组16只；每组各自随机分两亚组，一组甲醛溶液固定1周，一组甲醛溶液固定6个月，每个亚组8只。麻醉后将动物固定于实验台，先行剪去四肢体毛后，用脱毛剂脱净兔毛，用去离子水反复冲洗3次，自然干燥。将自制电极片连接电极后固定于左后肢中部，另一极固定于左前肢。电击条件：220V交流电，通电时间5s。部分兔子在通电后即死亡，部分未死亡兔子采取空气栓塞致死。即刻沿电击边缘完整提取左后肢触电部位皮肤，剔除多余的脂肪组织，并等分为两份，一份直接用于检测，一份于甲醛溶液固定后再检测，一组在甲醛溶液固定1周后取出，一组在甲醛溶液固定6个月后取出；同时提取右后肢相应部位正常皮肤作为对照组。所有检材均先置于电热恒温培养箱（60℃）干燥2h后备检。

1.4 检测

1.4.1 工作溶液配制[3]

内标工作溶液：吸取适量的内标储备液用5%硝酸溶液配制得质量浓度为20 μg/L的内标工作溶液。置于冰箱冷藏保存。混合标准工作溶液：吸取适量的混合标准储备液于样品瓶中，加5%硝酸溶液逐级稀释得混合标准工作溶液，各元素质量浓度均为100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.001 μg/L。混合标准工作溶液置于冰箱冷藏保存。

1.4.2 样品前处理

分别精确称量样本置于消解罐中，加入3 mL 65%硝酸溶液，将消解罐装入消解装置进行消解，消解程序见表1[3]。消解完成后，取出消解罐，待其温度降至室温后将消解液转移至ICP-MS专用样品瓶，并用少量去离子水连续冲洗消解罐3次，合并倒入样品瓶，继续加入去离子水至40.0 g。同时精确称量电击材料，加入适量65%硝酸消解后，逐级稀释至200倍待测。

表1 微波消解程序

1.4.3 ICP-MS分析条件

采用标准模式进行检测，仪器用调谐溶液调谐，在整个质量范围内具有高灵敏度及低干扰水平（CeO+/ Ce+<1%和Ce2+/Ce+<3%）。ICP-MS相关参数为：RF功率1500 W，采样深度8.1 mm，载气流速0.86 L/min，补偿气流速0.22 L/min，同心雾化器，雾化室温度2℃，采用屏蔽矩系统，蠕动泵转速0.1 r/min。以115In元素作为内标，并采用在线内标加入法将内标工作液和样品消解液一并通过蠕动泵导入ICP-MS系统。ICP-MS检测器模式采用自动模式，元素的积分时间为23s，每种元素重复测定次数为3次。

1.5 统计方法

采用SPSS for windows 15.0软件包，应用区组设计多样本均数比较的方差分析或非参数检验进行统计学处理，所得数据采用均数±标准差表示，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 线性关系和线性范围

混合标准工作溶液经测定，各金属元素响应值（y）与质量浓度（x）的线性方程、相关系数（r）和线性范围见表2。

表2 工作溶液的线性相关系数、线性方程、线性范围（μg/L）

2.2 电极材料中金属元素组成及含量

黄铜、铁电极材料中元素组成及含量详见表3。

表3 黄铜及铁电极元素组成及含量（μg/g）

2.3 黄铜电击皮肤检测结果

黄铜电击后皮肤检测出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，与对照组存在明显差别，皮肤固定1周、6个月后仍可检测出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，与对照组比较差异有统计学意义，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量固定前、后差异无统计学意义；虽然固定后Ni元素含量降低，但与对照组间仍存在差别，该实验结果表明甲醛溶液固定后黄铜电击皮肤中沉积的金属元素测定仍具有价值。详见表4、表5。

2.4 铁电击皮肤甲醛溶液固定后检测结果

铁电击皮肤中检测出Fe、Cr、Mn、Ni元素成分，与对照组存在差异具有统计学意义，固定1周和6个月后Fe、Cr、Ni元素含量与固定前差异均无统计学意义，且固定后Fe、Cr、Mn、Ni元素含量与对照组差异具有统计学意义；固定后Mn元素含量比固定前Mn元素含量降低，但与对照组比较固定前后Mn元素含量均无统计学意义；该实验结果表明甲醛溶液固定后铁电极电击皮肤中沉积的金属元素测定仍具有价值。详见表6、表7。

表4 黄铜电击后及甲醛溶液固定后1周后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

表4 黄铜电击后及甲醛溶液固定后1周后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

1）与正常对照组比较，P＜0.05；2）与固定前比较，P>0.05

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表5 黄铜电击后及甲醛溶液固定后6个月后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

表5 黄铜电击后及甲醛溶液固定后6个月后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

1）与正常对照组比较，P＜0.05；2）与固定前比较，P>0.05

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表6 铁电击后及甲醛溶液固定1周后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

1）与正常对照组比较，P＜0.05；2）与固定前比较，P>0.05

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表7 铁电击后及甲醛溶液固定6个月后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

表7 铁电击后及甲醛溶液固定6个月后兔子皮肤中各种金属元素含量变化

1）与正常对照组比较，P＜0.05；2）与固定前比较，P>0.05

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3 讨论

目前对电流损伤的研究表明皮肤金属化对电流斑的诊断有很高价值，可作为电流损伤皮肤的特异性诊断指标，同时检测这些可疑电流损伤的金属元素就可以推断其与金属材料的接触和确定电极的主要成分[1]。对皮肤金属化研究多集中在电流损伤的直接检测，对日常检案中经过甲醛溶液固定后的电击皮肤国内外很少有人研究。王晓峰[4]等人利用原子吸收分光光度计检测10%甲醛溶液固定后皮肤上铜元素含量，得出甲醛溶液固定后进行金属元素的检测仍有实际意义。ICPMS可以进行多种元素同时检测，分析速度快，检测元素种类多，对电击材料的来源的推测提供更可靠的证据。本课题组前期研究发现，ICP-MS可作为电流损伤皮肤金属化的有效检测手段，通过定量分析亦可进一步推断触电材料[1]。

本研究通过用黄铜、铁电极材料对兔子进行电击，电击后皮肤经过甲醛溶液固定1周和6个月，研究甲醛溶液固定对皮肤金属化检测的影响。根据组织切片的制作和检材销毁处理的时间，本研究分别选取1周和6个月为甲醛溶液固定的时间点。对于电流斑不明显，而组织学检验电流损伤不明显的案例，需要利用皮肤金属化检测进行辅助诊断，此时皮肤固定时间已经达到1周；对于重复鉴定案例，此时皮肤固定已经达到几个月之久，此时对固定后皮肤金属化检测的可靠性、有效性仍然需要进行探讨。因此，本研究选取上述两个时间点对皮肤进行甲醛溶液固定后，利用电感耦合等离子体质谱技术进行检测。

可以看出，黄铜电击后皮肤检测出Cr、Ni、Cu、Zn、 Pb成分，与对照组存在明显差别，皮肤固定1周、6个月后仍可检测出Cr、Ni、Cu、Zn、Pb成分，其中Cr、Cu、Zn、Pb含量固定前后无明显差别，Ni元素含量固定后减少，但与对照组间仍存在差别，分析Ni元素含量减少的原因，可能是本身电极中Ni的含量比较少，导致沉积于皮肤的量也比较少，或由于浸泡粘附于表面的Ni元素脱落。铁电击皮肤中检测出Fe、Cr、Mn、Ni元素成分，与对照组存在明显差别，固定1周和6个月后Fe、Cr、Ni元素含量与固定前无明显差别，固定后Mn元素含量比固定前Mn元素含量降低，但与对照组比较固定前后Mn元素含量均无统计学意义；分析Mn元素含量减少的原因亦可能是本身铁电极中Mn的含量就比较低，沉积于皮肤中的Mn元素也比较少，或由于浸泡使沉积于皮肤中的金属元素减少。

4 结论

在甲醛溶液固定后虽然有部分金属元素含量减少，但主要的金属元素种类和含量变化不大，说明电击后皮肤即使经过长时间甲醛溶液固定，仍可应用ICPMS进行皮肤金属化检测，可作为皮肤电流损伤的诊断依据。同时通过主要元素的种类和含量比较，仍可进行触电材料的同一性推断分析，比如黄铜电击甲醛溶液固定后皮肤同时检测出Cr、Ni、Cu、Zn等元素，铁电击皮肤甲醛溶液固定后同时检测出Cr、Fe、Ni等元素，部分微量元素的检出在电击材料的同一性推断中，起到重要作用。

[1]Marcinkowski T，Pankowski M.Significance of skin metallization in the diagnosis of electrocution[J].Forensic Sci Int，1980，16（1）：1-6.

[2]陈圆圆，张建华，马栋，等.电感耦合等离子质谱法检测电流损伤皮肤中金属元素[J].法医学杂志，2010，26（1）：6-9.

[3]马栋，沈敏，卓先义，等.血液中Cr、Cd、As、Tl和Pb的电感耦合等离子体质谱分析[J].法医学杂志，2009，25（1）：37-39.

[4]王晓峰，龚利麻，孙景文.电烧伤皮肤金属元素的测定.中国法医学杂志[J].1987，2（2）：101-103.

（本文编辑：刘宁国）

Influence of Formalin Fixation on ICP-MS Detection of Metal Elements in Skin in Electric Injury

ZHANG Jian-hua1，CHEN Yuan-yuan1，2，MA Dong2，LI Li1，3，CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic Medicine，Medical College of Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Department of Forensic Medicine，Shanghai Medical College，Fudan University，Shanghai 200032，China）

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.01.006

1671-2072-（2011）01-0026-04

2010-07-22

中央级科研院所公益性项目（GY0707）

张建华（1976-），男，主检法医师，主要从事法医病理学研究。E-mail：zjh7693@163.com。

陈忆九（1962-），男，研究员，硕士研究生导师，主要从事法医病理学研究。E-mail：yijiuchen@yahoo.com.cn。