固相萃取-气相色谱法检测生物检材中斑蝥素

白璐，李倩，房宁，陈东

（1.北京市疾病预防控制中心，北京100020；2.北京市大兴区疾病预防控制中心，北京102600）

固相萃取-气相色谱法检测生物检材中斑蝥素

白璐1，李倩2，房宁2，陈东1

（1.北京市疾病预防控制中心，北京100020；2.北京市大兴区疾病预防控制中心，北京102600）

目的建立固相萃取-气相色谱法检测生物检材中斑蝥素的方法。方法采用HLB固相萃取柱提取，气相色谱-内标法检测。结果斑蝥素在0.1～200mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.999以上；精密度（RSD）小于5%。对于添加血样，方法检出限为0.05μg/mL，加标回收率范围为93.03%～98.29%。结论该方法操作简便、快速、灵敏，提取回收率高，提取物含杂质较少，可用于实际案件中全血和尿样中斑蝥素的检测。

斑蝥素；固相萃取；气相色谱法

Abstract：ObjectiveTo develop a solid phase extraction-gas chromatography method for the determination of cantharidin in biological samples.MethodsSamples were purified by using HLB solid phase extraction column and detected by gas chromatography with internal standard added.ResultsThe recovery rate of cantharidin in biological samples ranges from 93.03%to 98.29%，the limit of detection is 0.05μg/mL.The method showed excellent linearity（the linear correlation coefficient is 0.9990）.ConclusionThe method could be applied in forensic toxicological analysis of cantharidin in blood and urine samples with the advantage of simple and quick operation，high recovery rate，good repetition and clean extraction.

Key words：cantharidin；solid phase extraction；gas chromatography

斑蝥素是常见中药材斑蝥体内的一种天然单萜类昆虫毒素，外用对皮肤有止痒、改善局部神经营养及刺激毛根、促进毛发生长的作用，因其毒性较大，中华人民共和国卫生部《化妆品卫生规范》规定其为育发类化妆品限用物质。斑蝥可与人参、黄芪、刺五加、三棱等药制成复方斑蝥胶囊，具有破血消瘀、攻毒疗疮的功效，临床用于治疗原发性肝癌、肺癌、直肠癌等恶性肿瘤[1]。民间常有轻信谬传而误用斑蝥作偏方，用于防治狂犬病、堕胎，治疗月经不调、不孕、银屑病等。斑蝥有大毒，治疗剂量和中毒剂量相差不大，用药稍有不慎即可引起中毒甚至死亡，故斑蝥中毒是法医实际工作中常见的检案。建立准确、快速、灵敏的方法来检测生物检材中斑蝥素，可解决法医实际工作中的困难。

目前，国外已有文献报道采用气相色谱-质联用法测定血清中斑蝥素的含量[2]，国内有报道采用气相色谱法测定育发液、胶囊、口服液和片剂中斑蝥素的含量[1，3-5]，在已有的检测方法中，样品的前处理几乎均是采用了传统的液-液萃取法[6-7]，试剂消耗量多，对环境污染和人体健康影响大。为简化前处理的步骤，减少有机试剂的使用，本研究采用目前较为常用的固相萃取技术，建立了固相萃取-气相色谱法检测全血和尿液中斑蝥素的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

GC-2010色谱仪，配FID检测器和GC Solution色谱数据工作站（日本岛津公司）；微型漩涡混合仪（WH-90A，上海振荣科学仪器有限公司）；台式高速离心机（TGL-20，湖南星科科学仪器有限公司）；UPW-50N超纯水机（北京历元电子仪器技贸公司）；氮吹仪（TTL-DCI）；Whatman GF/A玻璃纤维滤纸；DB-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）色谱柱；Waters Oasis HLB固相萃取柱（6cc，150mg）。

1.2 试剂

斑蝥素对照品（由中国药品生物制品检定所提供），内标正十六烷、甲醇、丙酮（色谱纯），盐酸（分析纯）。斑蝥素对照品储备液（1mg/mL）和内标溶液（0.1 mg/mL）用丙酮配制，于-20℃冰箱内保存。实验用水为超纯水（18.2MΩ·cm）。

1.3 色谱条件

气体流速：氮气30 mL/min，氢气40 mL/min，空气400mL/min。柱温180℃，进样口温度180℃；检测器温度200℃。分流比为5∶1。进样量1μL。

1.4 样品前处理

1.4.1 血液前处理

取2mL血液于50mL锥形瓶中，加20mL 0.1mol/L HCl，于沸水浴中加热10min，放冷，过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至3。滤液过HLB固相萃取柱，流速为1～2mL/min，用6mL超纯水清洗柱子，真空抽干后用5mL甲醇洗脱。挥干洗脱液，残渣用0.1mL丙酮定容，漩涡混匀2 min，并以离心半径6.412cm，10000 r／min离心5min，取上清液，供气相色谱分析。

1.4.2 尿液前处理

取20mL尿液于烧杯中，滴加0.1mol/L HCl，调节pH至3。滤液过HLB固相萃取柱，流速为1～2mL/min，用6mL超纯水清洗柱子，真空抽干后用5mL甲醇洗脱。挥干洗脱液，残渣用0.1mL丙酮定容，漩涡混匀2min，并以离心半径6.412cm，10 000 r／min离心5 min，取上清液，供气相色谱分析。

2 结果

2.1 专属性

在选定的实验条件下，斑蝥素有良好的色谱峰，保留时间为3.838min，与内标正十六烷和其它杂质完全分离（图1），分离度超过1.5。空白血、尿提出物在相同的色谱条件下无干扰（图2～3），内源性杂质与目标物分离良好，该方法具有良好的专属性。

2.2 标准曲线

将斑螯素贮备溶液用丙酮分别稀释成质量浓度为0.1、1.0、10.0、100.0和200.0 mg/L的系列溶液，将系列溶液分别与等体积的内标溶液混合均匀，然后准确吸取1.0μL注入气相色谱仪，以斑螯素的质量浓度（x）为横坐标，斑蝥素色谱峰面积与内标正十六烷色谱峰面积之比（y）为纵坐标，绘制标准线性回归曲线。线性方程为y=2903x-322，r=0.9998，线性范围0.1～200mg/L。

图1 标准液中斑蝥素和内标正十六烷色谱图

图2 空白血（经固相萃取）的色谱图

图3 空白尿（经固相萃取）的色谱图

2.3 工作曲线及检出限

向空白血样中添加斑蝥素对照品溶液，得到质量浓度为0.1、1.0、10.0、100.0和200.0 mg/L的系列溶液，充分混匀，按照全血样品前处理方法进行萃取。将前处理液分别与等体积的内标溶液混合均匀，然后准确吸取1.0μL注入气相色谱仪，以斑螯素的质量浓度（x）为横坐标，斑蝥素色谱峰面积与内标正十六烷色谱峰面积之比（y）为纵坐标，绘制全血样品中斑蝥素回归方程为y=2312 x+86.5，线性良好，r=0.9990，线性范围0.1～200mg/L。

同理，得到尿液中斑蝥素回归方程为y=2 258 x-174，线性良好，r=0.9992，线性范围0.1～200mg/L。

以基线3倍噪声所对应的斑蝥素质量浓度作为检出限，以基线10倍噪声所对应的斑蝥素质量浓度作为定量限。全血样品的检出限为0.05 μg/mL、定量限0.15 μg/mL；尿样的检出限为0.005 μg/mL、定量限0.015μg/mL。

2.4 方法准确度、精密度和加标回收率

配制高、中、低三种质量浓度（0.75、5.00、20.0mg/L）添加血样，每个质量浓度配制5份，一天内早、中、晚测3次，连续测5d。以工作曲线计算质量浓度，求得准确度和精密度（RSD）。

表1 添加血样的准确度和精密度（n=5）

内标正十六烷精密度：在考察斑蝥素精密度的同时也考察了内标正十六烷的精密度，结果日内精密度＜1.2%，日间精密度＜2.3%。

配制高、中、低三种质量浓度（5.00、20.0、50.0mg/L）添加血样，每个质量浓度配制6份，检测后以工作曲线计算浓度，求得三种质量浓度的加标回收率分别为（93.03±3.4）%、（98.29±2.8）%、（94.55±3.7）%，平均回收率为95.29%。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

生物检材中，斑蝥素含量较低且基质成分较为复杂，给检测带来一定困难，通过对DB-1和DB-5两种不同的色谱柱进行比较试验，结果显示用DB-5毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）能将斑蝥素与其它基质成分有效地分离，可达到检测要求。

3.2 色谱条件的优化

同时考察柱温为160℃、180℃、200℃的分离效果。柱温160℃，保留时间为4.560min，灵敏度低；柱温200℃，分析速度快，保留时间为2.891min，但分离效果差；柱温180℃，分离度超过1.5，峰形良好，保留时间适宜（为3.8min左右）。

3.3 样品前处理方法

斑蝥素系内酸酐结构，当溶液酸化后以斑蝥素分子形式存在，能够被HLB固相萃取柱填料上键合的非极性基团所富集，因此回收率高；而在碱性水溶液中斑蝥素水解生成斑蝥酸盐而溶解，不能够被HLB柱很好的富集，因此回收率较差。

所以样品pH的变化，对HLB固相萃取柱的富集效果影响很大。本研究采用超纯水加标实验，考察了不同pH条件下样品的富集效果。具体操作方法：取超纯水样4份，每份20mL，分别用盐酸和氨水调节样品的pH值为3、5、7、9，水样以大约5mL/min的速度流过HLB萃取柱，水样过柱后，用真空泵抽去残留在小柱上的水分，用5.00mL甲醇洗脱吸附在柱上的待测物，氮气吹干，用0.1mL丙酮定容，上机测定。测得回收率分别为（98±3）%、（72±2）%、（48±5）%、（21±3）%，pH=3时样品的回收率最高。

4 结论

综上所述，所建立的固相萃取-气相色谱法可用于检测全血样本、尿样中的斑蝥素，且具有样品预处理提取完全、提取物含杂质较少、回收率高、重现性好、灵敏、稳定等优点，适用于法医实际工作。

[1]刘传华，陈运久，刘师莲，等.气相色谱法测定复方斑蝥胶囊中斑蝥素含量[J].山东中医杂志，2002，21（3）：180-181.

[2]Steyn JM，Hundt HKL.Gas chromatographic-mass Spectrometric method for the quantitation of cantharidin in human serum[J].Chiomatogr Biomed Appl，1988，76：177-179.

[3]赵松华，张卫国，付家华.气相色谱法测定育发类保健用品中斑蝥素含量[J].中华预防医学杂志，2002，36（4）：269-270.

[4]曹红，祝业，陈玉敏，等.毛细管气相色谱法测定抗鼻咽癌口服液中斑蝥素的含量[J].中国新药杂志，2007，16（4）：309-310.

[5]黄燕萍，张若燕.气相色谱法测定复方斑蝥片中斑蝥素的含量[J].中成药，2008，30（2）：282-283.

[6]李晓飞，陈祥盛，国兴明.芫菁科昆虫体内斑蝥素的气相色谱法测定[J].昆虫知识，2007，44（3）：459-460.

[7]李英，王成云，杨左军，等.气质联用法测定生发类化妆品中斑蝥素[J].中国卫生检验杂志2001，11（4）：645-646.

（本文编辑：卓先义）

Determination of Cantharidin in Biological Samples by Solid Phase Extraction-Gas Chromatography Method

BAI Lu1，LI Qian2，FANG Ning2，CHEN Dong1
（1.Beijing Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100020，China；2.Daxing District Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102600，China）

DF794.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.02.012

1671-2072-（2011）02-0057-03

2010-08-09

证据科学教育部重点实验室开放基金资助项目（09KFKT003）

白璐（1975-），女，主管医师，硕士研究生，主要从事毒（药）物分析研究。E-mail：bailu1975@126.com。