黄斑姜中期染色体CPD染色和45S rDNA荧光原位杂交分析

赵丽娟, 郭 敏

(怀化学院11生命科学系; 2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室; 31湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化 418008)

黄斑姜中期染色体CPD染色和45S rDNA荧光原位杂交分析

赵丽娟1,2,3, 郭 敏1

(怀化学院11生命科学系; 2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室; 31湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化 418008)

为了对黄斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong1)的染色体进行识别并对该物种基因组的结构进行初步研究,利用PI和DAPI组合(CPD)染色和45S rDNA探针荧光原位杂交对中期染色体进行了分析.结果显示,黄斑姜具有2对45S rDNA位点,分别位于第3、4号染色体的短臂,对应于相应染色体上的显著的CPD带区1基于rDNA位点和染色体测量数据,建立了黄斑姜的准确而详细的分子细胞遗传学核型.黄斑姜核型公式为2n=2X=22= 12m+6sm+4st(SAT),其核型不对称性为2B型.

黄斑姜; 核型; CPD染色; 45S rDNA; 荧光原位杂交

黄斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong)为姜科(Zingiberaceae)姜属(ZingiberBoehm1)植物.我国现有的黄斑姜大都产云南南部的勐腊、景洪[1];生于海拔580—1 500米的常绿阔叶林下,花期7—8月,果期9—12月.迄今为止,对黄斑姜的研究大多是形态学、栽培技术、营养价值和保健作用等方面[2-3],核型分析、DNA物理定位和基因组结构分析的报道很少,因此对其进行分子细胞遗传学研究十分必要.

本研究取新生根尖分生区作为材料,采用去壁低渗火焰干燥制片法[4]制备形态良好的有丝分裂中期染色体,并采用改良的CPD染色技术和45S rDNA荧光原位杂交技术对黄斑姜的染色体进行分析,为识别黄斑姜的染色体提供新的标记,并结合染色体常规测量,建立其分子细胞遗传学核型.

1 实验材料与方法

供试材料黄斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong),由中科院昆明植物研究所黄老师提供1

45S rDNA探针来自番茄基因组,由美国Nebraska大学Arumuganathan教授提供145S rDNA片段长度为911 kb,包括518S,18S和25S亚单位和非转录的间隔区(IGS),克隆载体为pUC18,酶切位点为K pn I.

有丝分裂染色体用根尖按Song等[4]的方法制备1将黄斑姜置于沙土中于温室中培养,待根长到1～115 cm时剪取根尖,用α—溴代萘室温下处理1 h1用甲醇:冰醋酸(3:1)于4℃固定过夜1固定的根尖水洗后用1%的纤维素酶(CellulaseRS)、1%的果胶酶(Pectolyase Y23)及1%的蜗牛酶(Cytohelicase)的混合液(用柠檬酸缓冲液配制,pH 4.5)于28℃酶解6 h.火焰干燥法制片.染色体制片置-20℃贮存备用.

CPD染色参照佘朝文等的方法进行[5].观察在Olympus BX60荧光显微镜下进行,用紫外光滤色片(UV)观察DAPI染色,用绿色激发滤色片(WG)观察PI染色.利用冷凝CCD照相系统(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph软件拍摄和合成照片1

荧光原位杂交在已进行CPD的染色体装片上进行.原位杂交和信号检测按佘朝文的方法[5]进行.染色体用DAPI复染,用Olympus BX60荧光显微镜观察染色体和杂交信号,用冷凝CCD照相系统(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph软件拍摄和合成照片1

图片处理和染色体测量使用Adobe Photoshop软件进行,核型分析参照李懋学和陈瑞阳[6]的方法进行1

2 结果

黄斑姜染色体经CPD染色后,有两对染色体出现了显著的红色CPD带纹(图1A,白色箭头所示),说明该染色体区段为GC丰富区[5],通过观察多个分裂相发现,这两对染色体具有随体,CPD带位于短臂的次缢痕近端一侧.相继的45S rDNA FISH显示,黄斑姜具有2对45S rDNA位点(图1B,白色箭头所指绿色信号),对应于相应染色体上的显著的CPD带区,而且CPD带和FISH信号的大小和强度上也是对应的.

图1 黄斑姜染色体的CPD显带(A)、45S rDNA荧光原位杂交(B)、核型(C)和核型模式图(D)

表1 黄斑姜的核型分析参数表

基于CPD带和45SrDNA FISH信号,结合常规的染色体测量(表1),对黄斑姜的染色体进行区分、配对,建立了体现它们染色体基本形态特征、CPD带及45S rDNA位点分布情况的分子细胞遗传学核型(图1C).核型分析结果表明,显著的CPD带和对应的45S rDNA杂交信号分别位于第3、4对染色体的短臂.黄斑姜的核型公式为2n=2x=22=12m+6sm+4st(SAT).根据染色体长度进行分类的方法[6,7],最长和最短染色体的比值是2.25,臂比大于2的染色体的比例为0.27,因此核型不对称性属2B型.核型模式图见图1D1

3 讨 论

本研究中采用了CPD染色对黄斑姜的染色体进行分析.CPD染色能够精确的显示植物基因组的GC丰富的45S rDNA位点[5].我们的结果表明,所有的45S rDNA杂交信号都出现在相应染色体位置的CPD带区,说明CPD染色能有效地对45S rDNA进行物理定位.黄斑姜与在大麦、四棱豆、番茄等物种上检测到非rDNA CPD带不同[8],其CPD带只专一地显现在核仁组织区(NOR).

已有的研究报道了姜属的其他种植物的染色体数目[9,10],但并没有进行核型分析.已报道的姜属植物的染色体都为2n=22[9,10]1Mahautyh(1970)认为姜科植物姜属的染色体基数为11,而且几乎全是二倍体[11]1我们的结果显示黄斑姜也是二倍体,其染色体为2n=22,其染色体基数也为11.

我们的实验对黄斑姜染色体的45S rDNA位点进行了FISH定位,明确其具有2对45S rDNA位点145S rDNA FISH不仅能够准确识别植物的rDNA位点,而且其杂交信号还可以作为标记用于核型分析中染色体的精确识别,而且通过同一属不同物种的45S rDNA比较定位分析,还以探讨物种间的进化关系[12].因此我们的研究对进一步从分子细胞遗传学水平研究姜属的基因组及物种间的进化关系具有重要意义.

姜属植物的细胞遗传研究材料常取自室外培养的植物,较难获得理想的染色体装片,这也是姜属植物染色体研究进展缓慢的原因之一1本实验的染色体制备方法对其他姜属植物的细胞遗传学研究也具有重要的参考价值1

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Abstract:In order to identify the chromosomes ofZingiber flavo-maculatumS.Q.T ong.and reveal preliminarily the genome organization,CPD(combined PI and DAPI)staining and FISH with 45S rDNA probe were applied to analyze the mitotic metaphase chromosomes.Two pairs of 45S rDNA sites were detected on the short arms of the chromosome 3 and 4,respectively, corresponding to the prominent red CPD bands.The molecular cytogenetic karyotypesofZingiberflavo-maculatumwas constructed based on the data of rDNA and chromosome measurements.The karyotype formula is 2n=2X=22=12m+6sm+4st(SAT)and the karyotype asymmetry belongs to 2B type.

Key words:Zingiber flavo-maculatum; karyotype; CPD staining; 45S rDNA; fluorescence in situ hybridization(FISH)

Analysis of Mitotic Metaphase Chromosomes ofZingiber flavo-maculatum using CPD Staining and FISH with 45S rDNA Probe

ZHAO Li-juan1,2,3, G UO Min1
(1.Department of Life Sciences; 2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province;
31Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plants and Ethnobotany of Hunan Higher Education,Huaihua University,Huaihua,Hunan 418008)

Q343

A

1671-9743(2011)02-0045-03

2011-02-10

湖南省教育厅一般项目(07C503).

赵丽娟(1979-),女,湖南溆浦人,怀化学院讲师,硕士,主要研究遗传学.