苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究

张丽艳，王玉田，耿丽晶

(辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121001)

苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究

张丽艳，王玉田*，耿丽晶

(辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121001)

研究苦瓜总皂甙的抑菌作用及抑菌条件。以苦瓜正丁醇浸提物为原料，研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。试验结果表明，苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显，最低抑菌浓度为30 mg/mL;抑菌最适pH值范围5～8;苦瓜总皂甙的热稳定性好，在121℃处理10 min仍具有较好的抑菌活性。金黄色葡萄球菌生长曲线表明，对数生长期的金黄色葡萄球菌对苦瓜总皂甙较敏感，而对接近稳定期的菌体抑制作用较弱。

皂甙;金黄色葡萄球菌;抑菌作用

苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属植物，性味苦寒，具有清热解毒、滋养强壮、降血糖等功效［1］。现代医学证明，苦瓜具有降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理作用。国内外研究已证实，苦瓜汁具有免疫调节、广谱抗菌作用，苦瓜提取液对细菌具有抗菌作用，苦瓜种仁蛋白对啤酒酵母菌、米曲霉菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显抑制效应［2-4］。为进一步开发利用这一资源，本实验对苦瓜浸出汁的抑菌效果进行研究，为其作为天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，本实验室保存菌种。

1.1.2 培养基LB营养肉汤培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L;牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。

1.1.3 试剂磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸，分析纯度。

1.1.4 仪器与设备恒温培养箱，上海一恒科技有限公司;冷冻干燥机，北京瑞帮兴业科技有公司;RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂; 723A可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乙醇浸提物苦瓜(市售)洗净，去籽，切片，晒干，粉碎后过40目筛得苦瓜粉。以80%的乙醇，料液比1∶15，60℃浸提2.5 h，5000 r/min离心15 min取上层清液，减压浓缩，真空冷冻干燥得乙醇浸提物。

1.2.2 苦瓜总皂甙制备［5］苦瓜乙醇浸提液，配制成浓度为100 mg/mL的溶液，加入5%的氢氧化钠，搅拌使溶解;加入1.25倍量水饱和正丁醇动态萃取2次，分取正丁醇液;加5%氢氧化钠溶液1倍量，动态洗涤1次，分取正丁醇液;加水1倍量，动态洗涤2次并调节溶液pH至中性，分取正丁醇液，即苦瓜总皂甙溶液，备用。

1.2.3 菌悬液的制备［6］金黄色葡萄球菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养24 h，用无菌生理盐水分别将各新鲜平板培养物洗下，以无菌生理盐水配制成吸光度值OD600=0.1菌悬液，使用时稀释10倍。

1.2.4 滤纸片法测定抑菌效果实验取苦瓜总皂甙溶液，用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的小圆滤纸片，干热灭菌后，在无菌操作下，将滤纸片放入样液中，浸泡0.5～1 h。吸取100 μL菌悬液与45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15 mL混合摇匀，倒入培养皿中冷却制成含菌平板。再将含有样液的滤纸片沥水，微干后均匀铺在含菌平板表面，37℃培养24 h。

1.2.5 试管法检测最低抑菌浓度(MIC)将灭菌后的苦瓜总皂甙溶液用无菌LB营养肉汤培养基配置成系列浓度稀释液，同时用生理盐水做空白对照，然后在无菌操作条件下，接种对数期的金黄色葡萄球菌液20 μL，摇匀，37℃培养24 h。

1.2.6 抑菌活性的稳定性通过对苦瓜总皂甙抑菌活性的稳定性研究，为其应用提供一定依据。本试验选用金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定了不同的时间、pH值、温度等对苦瓜总皂甙抑菌功能的影响。

1.2.7 抑制金黄色葡萄球菌生长实验［7］金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，用LB营养肉汤培养基将其稀释成含菌体107个/mL，于37℃，150 r/min培养36 h，每隔2 h取样测OD值，绘制对照组生长曲线;再取一定量对数期的金黄色葡萄球菌加入到含苦瓜总皂甙溶液的LB培养基中，使含菌体107个/mL，继续培养并每隔2 h取样测OD值，制作出苦瓜总皂甙作用后的金黄色葡萄球菌生长曲线(λ=600 nm)。

2 结果与分析

2.1 苦瓜总皂甙抑菌效果

将无菌滤纸片分别放入乙醇浸提液、正丁醇浸提液中进行抑菌效果实验，同时用正丁醇饱和水溶液和柠檬酸做对照，见图1。由图1可知，正丁醇饱和水溶液对金黄色葡萄球菌无抑制作用，正丁醇浸提液的抑菌效果优于乙醇浸提液，但比柠檬酸的抑菌作用弱。这表明正丁醇提取液中苦瓜皂甙浓度高，且纯度高。

图1 苦瓜总皂甙抑菌效果实验Fig.1Bacteriostasis tests of total saponins from Momordica charantia L.

2.2 苦瓜总皂甙最小抑菌浓度

苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌的抑菌结果见表1。由表1可知，苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，最低抑菌浓度为30 mg/mL。

2.3 苦瓜总皂甙抑菌曲线［8］

取含有高浓度苦瓜总皂甙溶液的培养基，在37℃的培养条件下，培养金黄色葡萄球菌，分别在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取样测活菌数，用含有生理盐水的培养基做空白对照，结果见图2。未加苦瓜皂甙的对照组金黄色葡萄球菌保持原有菌数，并略有增长。加入苦瓜皂甙的实验组中，随着时间的延长金黄色葡萄球菌的活菌数下降，24 h后活菌数接近零，即菌体基本被抑制。

表1 苦瓜总皂甙最小抑菌浓度(MIC)Table 1The MIC of total saponins from Momordica charantia L.

图2 苦瓜总皂甙的抑制曲线Fig.2Bacteriostatic curve of total saponinsfrom Momordica charantia L

2.4 pH值对苦瓜总皂甙抑菌活性的影响［9］

取制备好的正丁醇浸提液，用不同pH值的缓冲液将其稀释成质量浓度为样品液1/10的溶液，用乳酸和NaOH调节各溶液的pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，并以不同pH值的缓冲溶液生理盐水为对照，静置24 h后，以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定其抑菌效力。由表2可知，苦瓜总皂甙在强酸、强碱环境下几乎无抑菌作用;在弱酸性条件下，抑菌效果不明显;在中性和弱碱性条件下，有较强的抑菌作用;苦瓜总皂甙抑菌pH值范围是5～8。

2.5 温度对苦瓜总皂甙抑菌作用的影响

把苦瓜总皂甙溶液置于电热恒温箱中，并分别在0、10、30、60、80、100℃这6个温度下保温，并在－20℃和121℃湿热条件下各处理10 min，紫外灯下杀菌25 min，用原液作对照，以抑菌圈直径为指标判定处理前后样品的抑菌效力，实验重复3次，取平均值，结果见图3。苦瓜总皂甙经不同温度处理后其抑菌效果差别不大，基本保持原有的抑菌效力，表明苦瓜总皂甙的抑菌活性具有较好的热稳定性。

表2 pH值对苦瓜总皂甙抑菌活性的影响Table 2Effect of pH on total saponins from Momordica charantia L.activity

图3 温度对苦瓜总皂甙抑菌作用的影响Fig.3Effect of temperature on total saponins from Momordica charantia L.activity

2.6 苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌生长的影响

金黄色葡萄球菌生长曲线见图4。由图4可见，加药组生长曲线有明显变化，细菌不能达到正常的生长高峰进入对数生长期，当菌体培养一段时间后，在延迟期菌体浓度保持不变且延迟期时间延长，表明苦瓜总皂甙对延迟期的菌体代谢可能有抑制作用;在对数生长期，菌体浓度略有上升，且短时间内其抑菌速率迅速增加;在稳定期，随着苦瓜总皂甙作用时间的延长，抑菌作用变弱，表明对数生长期的金黄色葡萄球菌可能对苦瓜总皂甙较敏感，而对接近稳定期的金黄色葡萄球菌抑制作用较弱。

图4 苦瓜总皂甙对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响Fig.4Effect of total saponins from Momordica charantia L.on growth curve of Staph.aureus

3 结论

苦瓜总皂甙作为天然植物食品防腐剂，其抑菌效果稍差于化学防腐剂，最低抑菌浓度为30 mg/mL，有较好的热稳定性，对弱酸、弱碱性食品同样适用。本文通过观察加药组金黄色葡萄球菌生长曲线可知，对数生长期的金黄色葡萄球菌可能对苦瓜总皂甙较敏感，而对接近稳定期的金黄色葡萄球菌抑制作用较弱，由于它无毒无副作用，对人体又有一定的保健作用，因而具有很高的实用价值。

［1］陈贵廷.本草纲目通释［M］.北京:学苑出版社，1992:12.

［2］Grover JK，Yadav SP.Pharmacological actions and potential uses of Momordica charantia［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，93:123-132.

［3］Sylvia LH，Huang PL，Chen HC，et al.Anti-HIV and anti-tumor activities of recombinant MAP30 from bitter melon［J］.Gene，1995，161:151-156.

［4］吴德雨，黄荣清.苦瓜中活性成分及药理药效［J］.科学技术与工程，2005，5(17):1282-1284.

［5］赖先荣，吴秦西，向永臣.黄芪总皂甙的纯化工艺［J］.现代生物医学进展，2009，9(2):301-303.

［6］张伟，徐建设，钟启平.柠檬提取物对多重耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用机理的研究［J］.中国消毒学杂志，2008，25 (6):598.

［7］韩永斌.紫甘薯花色苷色素抑制金黄色葡萄球菌作用初探［J］.食品科学，2008，29(10):60.

［8］韩淑琴，杨洋，黄涛，等.仙人掌提取物的抑菌机理［J］.食品科技，2007，32(3):130-131.

［9］邢淑婕，刘开华.茶多酚对牛肉干中沙门氏菌的抑制作用研究［J］.食品科技，2007，32(5):150.

Bacteriostatic Activity of Total Saponins from Balsam Pear(Momordica charantia)against Staphylococcus aureus

ZHANG Li-yan，WANG Yu-tian，GENG Li-jing
(Coll.of Food Sci.＆Technol.，Liaoning Med.Uni.，Jinzhou 121001)

Bacteriostatic effect and condition of total saponins(Ts)from balsam pear(Momordica charantia)(Mc) against Staphylococcus aureus(Sa)was studied.The results indicated that Ts from Mc had obvious bacteriostatic effect against Sa and the minimum inhibitory concentration(MIC)was 30 mg/mL;and the best bacteriostasis pH was 5～8，also thermost ability of Ts from Mc was good;it maintained fairly good antimicrobial activity after treated for 10 min at 121℃of processing.Growth curve of Sa indicated that logarithmic growth phase of Sa sensitive to the saponins，while fairly weak when it close to stable stage.

saponins;Staphylococcus aureus;bacteriostatic effect

TS202.3

A

1005－7021(2011)01－0047－04

辽宁省工程中心基金(2010402004)

张丽艳女，硕士研究生。主要研究方向为畜产品质量与安全工程。E-mail:zhangliyan709@163.com

*通讯作者。Tel:0416-4672399，E-mail:wangyutian@163.com

2010-12-20;

2011-01-14