中药天年饮对衰老大鼠脾p53表达的作用

苏哲君，颜 勇，陈志宏

(1.承德医学院附属医院，河北承德 067000;2.承德医学院)

脾是机体重要的免疫器官，脾的功能在整个机体的免疫功能中占有重要地位[1];补肾、健脾是延缓衰老的重要方法。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，能填精补髓、乌发延年。本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型，观察天年饮对衰老大鼠脾p53表达的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 30只雄性SD大鼠(体重180-250g)随机分为3组:正常组、衰老模型组和天年饮用药组，每组10只。模型组和用药组大鼠均采用D-半乳糖连续腹腔注射(200mg/kg/d，40d)的方法建立亚急性衰老的动物模型;模型组大鼠造模成功后不再做任何处理，用药组大鼠造模成功后给予天年饮(16.2g/kg /d)灌胃30d。

1.2 药品与试剂 天年饮由灸何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓六味中药组成，熬制后每ml含生药1.5g。p53免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。

1.3 检测脾脏指数 大鼠称重，断头处死，取出脾脏后去除脂肪、筋膜后称重，计算脾脏指数，脾脏指数=脾脏重量/体重。

1.4 免疫组化染色及定量分析 称重后的脾脏入Bouin液固定，常规石蜡包埋，连续切片(片厚6μm)，贴于涂有APES的载玻片上。采用SABC免疫组化染色观察大鼠脾p53的表达情况(一抗为兔抗，稀释比例为1:100)，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用MiVnt图像分析系统进行定量分析:p53阳性切片在10×20倍显微镜下选取视野，计算阳性产物面积占视野面积的百分比。每只动物任选5张切片，每张切片选取3个视野，取平均值。

1.5 统计分析 采用SPSS 11.0统计软件，以方差分析进行统计处理，组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 各组大鼠脾脏指数 与正常对照组比较,衰老模型组大鼠脾脏指数显著下降(P＜0.05);中药天年饮可明显提高衰老大鼠的脾脏指数，用药组与衰老组比较差异显著(P＜0.05)。见附表。

2.2 各组大鼠脾p53的表达 p53蛋白阳性产物为棕黄色，位于细胞核。定量分析结果见附表:模型组大鼠脾p53的表达明显高于模型组大鼠(P＜0.05);中药天年饮灌胃可明显降低模型大鼠脾p53的表达，与模型组比较，用药组大鼠脾p53的表达明显降低(P＜0.05)。

附表 各组大鼠脾脏指数和脾p53的表达(±s，n=10)

附表 各组大鼠脾脏指数和脾p53的表达(±s，n=10)

与正常组比较:P＜0.05;与模型组比较:P＜0.05

组别 脾脏指数 p53正常组 0.466±0.063 0.0254±0.0111衰老模型组 0.347±0.0991 0.0598±0.01041天年饮用药物 0.451±0.1112 0.0352±0.01062

3 讨论

p53基因可参与细胞周期的调控，具有阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组的稳定及抑制肿瘤血管生成等多方面的功能[2]。p53 可通过bax/bcl-2、Fas/Apol、IGF-Bp3 等蛋白完成对细胞凋亡的调控作用;p53还可以通过死亡受体蛋白等途径诱导凋亡;另外还有学者认为p53还可直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基来引发凋亡[3]。真核细胞在进化过程中形成了一整套高度保守的纠错系统，当DNA出现异常时，p53蛋白及其转录活动明显增多，并使细胞周期停留在G1期，而不能进入S期，以便DNA修复，而不致复制有缺陷的DNA。如果DNA破坏严重不能修复，则p53可直接命令细胞凋亡[4]。

脾是机体重要的免疫器官，在异种抗原的刺激下脾小体分化增殖，产生B淋巴细胞及浆细胞，动脉周围淋巴鞘显著增厚，产生T淋巴细胞，这些变化均与体液免疫和细胞免疫密切相关。另外，脾还能产生与免疫调节有关的活性物质，脾的功能在整个机体的免疫功能中占有重要地位[1]。

延缓衰老的主要目的是提高生活质量、改善体质并有效延长机体寿命。本研究发现，丝胶可明显降低衰老大鼠脾p53的表达，表明天年饮可通过促进淋巴细胞的增殖能力来提高衰老机体的免疫功能，从而有助于防治老年病和延缓机体的衰老过程，说明中药天年饮具有一定的延缓衰老作用。

[1]Cesta MF.Normal structure,function and histology of the spleen[J].Toxicol Pathol,2006, 34(5):455-465.

[2]Takeuchi A, Mishina Y, Miyaishi O, et al. Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis[J].Nat Genet,2003,33(2):172-176.

[3]Oda E,Ohki R,Murasawa H,et al.Noxa,a BH3-only member of the bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis[J].Science,2000,288(5468):1053-1058.

[4]Finlay CA,Hinds PW,Levine AJ.The p53 proto-nocogene can act as a suppressor of transformation [J].Cell,1989,57(7):1083-1093.