糖尿病大鼠肾脏PEDF表达的变化及丝胶的保护作用

宋成军，杨振军，陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000)

研究认为，糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发生是以高血糖或血脂代谢紊乱为启动因素，诱导各种血管活性物质、生长因子、细胞介质、化学趋化因子、酶和蛋白质等多种因素综合作用所致，引发肾脏发生一系列病理变化，包括肾脏肥大、肾小球基底膜和肾小管基底膜增厚，以及肾小球系膜区ECM进行性积聚，进而导致肾小球硬化、肾间质纤维化，并出现蛋白尿、肾功能衰竭等[1-2]。本研究通过观察丝胶对DN大鼠肾脏色素上皮衍生因子(pigment epthelium-derived factor,PEDF)表达的变化，探讨丝胶保护糖尿病(diabetes mellitus,DM)肾脏损伤的作用，为临床治疗DN提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验分组 清洁级雄性SD大鼠48只，购自河北医科大学实验动物中心(合格证号:712024)。大鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组，每组12只。模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组大鼠均采用2% STZ(25mg/kg,3d)连续腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后，模型组大鼠不再作任何处理;丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d)灌胃，连续35天;丝胶预防组大鼠于注射STZ前给予同等剂量丝胶灌胃35天。

1.2 药物与试剂 STZ购于美国Sigma公司，临用时用pH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液。丝胶由彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，彩色蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供。血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司;兔抗PEDF抗体，武汉博士德生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 检测血糖 各组大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，3000r/min离心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4 肾脏PEDF蛋白表达的检测 各组大鼠取血后断头处死，迅速取双侧肾脏，一侧肾脏入液氮保存，用于Western Blotting检测;另一侧肾脏入Bounins液固定，用于免疫组化检测。

1.4.1 免疫组化染色及定量分析:入Bounins液固定肾脏，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。采用SP免疫组织化学染色法观察肾脏PEDF蛋白的表达。一抗为兔抗，稀释浓度为1:50，DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用MiVnt图像分析系统对免疫组化染色阳性结果进行定量分析:PEDF阳性切片在10×40倍显微镜下选取视野，计算阳性产物面积占整个视野面积的百分比。每只动物任选3张切片，每张切片选取3个视野，取平均值。

1.4.2 Western Blotting检测及定量分析:取200mg肾脏组织，提取蛋白，以BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度。采用Western Blotting法检测大鼠肾脏PEDF蛋白的表达，蛋白上样量为60μg。12% SDS-PAGE凝胶电泳、转膜;一抗稀释浓度为1:200，4℃过夜;Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantiy One软件对显影条带进行分析，以PEDF条带与β-actin条带的灰度比值作为PEDF蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS 12.0统计学软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖 与正常对照组比较，模型组大鼠的血糖明显升高(P＜0.01)。丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠的血糖明显低于模型组(P＜0.01)。见附表。

2.2 各组大鼠肾脏PEDF蛋白的表达 免疫组化染色结果:PEDF免疫阳性产物呈棕黄色颗粒状，位于肾小管上皮细胞胞浆;Western Blotting结果:在蛋白Marker的50KD水平处，可见PEDF蛋白条带;在蛋白Marker的43KD水平处，可见β-actin条带。与正常对照组大鼠相比，模型大鼠肾脏PEDF蛋白的表达明显下降(P＜0.01);丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肾脏PEDF蛋白的表达明显高于模型大鼠(P＜0.01)。见附表。

附表 各组大鼠血糖和肾脏PEDF蛋白的表达(±s)

附表 各组大鼠血糖和肾脏PEDF蛋白的表达(±s)

与正常对照组比较:*P＜0.01，与模型组比较:#P＜0.01

组别 血糖(mmol/L) 肾脏PEDF蛋白表达免疫组化法 Western Blotting法正常对照组 10.83±2.03 0.0193±0.0042 0.4013±0.050模型组 29.45±4.82* 0.0114±0.0025* 0.3385±0.014*丝胶治疗组 13.20±4.09＃ 0.0155±0.0023＃ 0.3915±0.058＃丝胶预防组 11.04±2.29＃ 0.0163±0.0030＃ 0.3942±0.058＃

3 讨论

DN是DM常见的严重微血管并发症，是引起慢性肾功能不全进而导致透析治疗或肾脏移植的重要病因之一。DN在DM人群中的发生率为20-40%，伴有终末期DN的患者5年生存率小于20%[3]。目前治疗DM多采用一些化学合成的药物，如二甲双胍、西他列汀、拜糖平等，虽然疗效可靠但副作用较大。即使是公认的经典首选药物—双胍类，在降低血糖的同时，易引起乳酸性酸中毒，死亡率较高[4]。正是这些毒副作用促使我们寻找一种降糖疗效可靠且毒副作用无或极少的治疗DM的新药物，因此我们选择了丝胶。

起源于我国的蚕丝业拥有几千年的悠久历史，但对蚕丝的应用主要集中于丝素方面，丝胶约占茧丝的30%，在缫丝和精练时极大部分作为废料而遭到遗弃[5]。丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的高分子水溶性蛋白，除含少量蜡质、碳水化合物、色素和无机成分外，主要成分为丝胶蛋白;丝胶蛋白由18种氨基酸组成，含有较多的丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸，其中7%左右是人体的必需氨基酸[6-7]。民间有蚕茧泡水降血糖的验方，本课题组的前期研究亦证实了这一点[8]。

PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SER-PIN)基因家族，广泛分布于全身许多组织器官，在肾脏主要分布于肾小管上皮细胞和肾小管间质，只有少量分布于肾小球[9]。PEDF在DN的发病中是一种保护性因素，它可抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管内皮细胞的增殖与迁移，降低肾小球毛细血管通透性，减少蛋白尿的排出，但PEDF抑制新生血管形成的机制目前尚不十分明确[10-11]。Stellmach等[12]的研究发现，人血管内皮细胞易受微环境的影响，培养液中内皮细胞凋亡数目随PEDF剂量的增加而增加;因此推测，PEDF可能通过促进活化的血管内皮细胞凋亡、使血管内皮细胞对缺氧诱发的新生血管形成的信号无反应来抑制新生血管形成。本研究发现，糖尿病大鼠肾脏PEDF的表达明显下降，加上对VEGF的抑制作用减弱，使肾小球毛细血管通透性增加及新生血管生成，从而导致蛋白尿及肾脏细胞外基质沉积，造成肾脏损害。

本研究发现，丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肾脏PEDF蛋白的表达明显高于糖尿病模型组大鼠。表明，丝胶可通过上调肾脏PEDF蛋白的表达，降低肾小球毛细血管的通透性及减轻细胞外基质沉积，发挥保护糖尿病肾脏损伤的作用;同时，丝胶预处理可以阻止糖尿病肾脏损伤的发生，具有良好的预防保护作用。

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