无血清悬浮法筛选人结肠癌干细胞样亚群的初步研究

苏 沐,张全安

(江苏省南京市肿瘤医院肿瘤内科,江苏南京,210003)

1994年,Lapidot等[1]首次提出肿瘤干细胞的概念。2003年,Al-Hajj分离鉴定出具有类似干细胞生物学特性的细胞群,首次在实体瘤中证明了肿瘤干细胞的存在。同年,Singh分离出一群细胞生物学特征和神经干细胞相似的细胞。从那以后,不断地有研究人员从肺癌、大肠癌、肝癌、肾癌及卵巢癌等肿瘤中分离获得肿瘤干细胞。本研究选取原代人结肠癌细胞为研究对象,通过对新鲜的结肠癌肿瘤组织进行原代培养,采用无血清悬浮法筛选人结肠癌干细胞样亚群,并做初步研究,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

无血清培养基(SFM)为不含牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基,并添加碱性成纤维生长因子bFGF、重组表皮生长因子EGF、白血病抑制因子LIF、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 mmol/L烟酰胺、5 mmol/L HEPES、1×105U/L青霉素G和100 mg/L链霉素。含血清培养基(SSM)为含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基,并添加L-谷氨酰胺2 ml/L,青霉素G 1×105U/L和链霉素100 mg/L。

1.2 方法

原代结肠癌细胞的培养:SFM法培养分离获得的结肠癌细胞,当细胞生长到80%融合时,传代。培养的前4代细胞在传代时每次都保留部分细胞冻存于液氮中。

四甲基偶氮唑蓝(MTT)法计算抑制率:将经SFM 培养获得的结肠癌细胞5×104/mL于96孔板的培养箱中孵育24h后,加入浓度分别为3.125 mg/L 、6.25 mg/L 、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L及100 mg/L的5-氟尿嘧啶(5-Fu),每个浓度设5个平行孔。另设阴性对照组和空白调零孔。孵育24～48 h后,加入MTT孵育4 h,自动酶标仪上测定OD 570值。抑制率=(1-实验组平均OD570值/对照组平均OD 570值)×100%。

流式细胞术(FCM)检测侧群(SP)细胞比例:每组细胞分置于A、B2管中,800r/min离心5 min;2管均加入5 μ g/mL的Hoechst 33342及无血清培养基;仅在 B管内加入50 μ mol/L的维拉帕米,水浴 37℃90 min。后置于4℃直至FCM检测SP细胞比例。

FCM检测细胞表面分子CD133的表达和RT-PCR半定量检测干细胞标记物Musashi-1:将细胞800 r/min离心5 min,分别加入20 μ LCD133单克隆抗体(4℃,30 min),冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次,于FCM 检测CD133+细胞比例;按TaKaRa试剂盒提供的说明书进行RT-PCR操作。Musashi-1引物下游序列为5′-GGAAACTGGTAGGTGTAG-3′,上游序列为 5′-GGCTTCGTCACTTACATGGACCAGGCG-3′。

细胞免疫化学显示Musashi-1表达:PBS洗涤玻片3次;甲醇/醋酸固定10 min;甲酰胺100℃5 min变性核酸;H2O2,37℃10 min;“A”液(封闭血清),室温10～15 min;加入 Musashi-1单克隆抗体,4℃,过夜;“B”液(生物素化二抗)置室温孵育30 min;滴加“C”液(S-P液),37 ℃下15 min;滴加Western显色(DAB)液;蒸馏水冲洗,苏木素复染30 s,水洗、干燥、封片。

克隆形成试验测定克隆形成率:制成5细胞/mL、10个细胞/mL密度的细胞悬液。取各密度的细胞悬液200 μ L接种于96孔细胞培养板中,置于37℃、5%的CO2培养箱中培养2周。镜下计数含50个细胞以上的克隆,并计算形成率。

2 结 果

2.1 原代结肠癌细胞的无血清培养及球样细胞团的形成

在SFM中,原代培养获得的结肠癌细胞经24～48 h后,大部分不贴壁,形成少量松散、悬浮生长、体积较小的细胞球(细胞数在8～10个左右)。1～2周细胞球体积增大,一部分细胞团崩解凋亡,细胞球形状较规则,球内折光性较好,细胞数增多,细胞间连接致密。培养2周时,难以区分细胞间的分界。接种于含SSM的原代结肠癌细胞,绝大部分贴壁生长,未见悬浮细胞球的产生,且生长较SFM组迅速。

表1 5-Fu对人结肠癌细胞的增殖能力( ±s,n=5)

表1 5-Fu对人结肠癌细胞的增殖能力( ±s,n=5)

与SSM 组比较,＊＊P<0.01。

5-Fu(mg/L)生长抑制率(%)SFM组 SSM组3.125 10.26±0.01＊＊ 18.63±0.04 6.25 21.77±0.01＊＊ 44.28±0.03 12.5 27.85±0.03＊＊ 53.26±0.03 25 43.23±0.04＊＊ 67.15±0.02 50 63.52±0.04＊＊ 70.21±0.02 100 70.64±0.02＊＊ 80.33±0.03

2.2 不同培养条件下,5-Fu对人结肠癌细胞生长抑制的影响

各浓度 5-Fu(3.125、6.25、12.5 、25 、50、100 mg/L)作用于结肠癌细胞48 h后的生长抑制率,见表1。5-Fu对SFM组和SSM组人结肠癌细胞的生长抑制作用均呈剂量依赖性;5-Fu对SFM组结肠癌细胞的抑制率明显低于SSM组的结肠癌细胞,2组间存在显著性差异(P<0.01)。

2.3 不同培养条件及5-Fu干预对SP细胞比例的影响

不同培养条件下人结肠癌细胞中的SP细胞比:SFM组SP细胞比例(5.13±1.78)%。SSM组SP细胞比例(0.56±0.46)%。经5-Fu干预后,SFM组中SP细胞比例变化为(9.3 6±0.59)%;SSM组中SP细胞比例变化为(3.28±0.78)%。

2.4 不同培养条件下及5-Fu干预后人结肠癌细胞CD133的表达

5-Fu干预前,SFM组CD133表达的细胞比例明显高于SSM组(P<0.01);经5-Fu干预后,SFM组中CD133+细胞仍明显多于SSM组(P<0.01)。同时,SFM组及SSM组中CD133+细胞比例在5-Fu干预后均有提高(P<0.01)。见表2。

表2 不同培养条件下及5-Fu干预后人结肠癌细胞CD133+细胞比例( ±s,n=5)

表2 不同培养条件下及5-Fu干预后人结肠癌细胞CD133+细胞比例( ±s,n=5)

与5-Fu干预前SSM组比较,＊＊P<0.01;与5-Fu干预后SSM组比较,##P<0.01;与5-Fu干预前SFM 比较,P<0.01。

组别 CD133+细胞比例(%)SFM 组 5-Fu干预前 6.71±0.03＊＊5-Fu干预后 12.84±0.16##SSM组 5-Fu干预前 2.05±0.15 5-Fu干预后 5.46±0.06＊＊

2.5 不同培养条件及5-Fu干预对Musashi-1表达的影响

2.5.1 Musashi-1 mRNA表达的不同:与SSM比较,SFM条件下,人结肠癌细胞中Musashi-1 mRNA的表达增加(P<0.05);5-Fu的干预可使得SSM组及SFM组Musashi-1 mRNA的表达均有进一步增加(P<0.05)。见图1。

图1 不同培养条件及5-Fu干预对Musashi-1 mRNA表达的影响

2.5.2 Musashi-1在细胞中表达的不同:Musashi-1的表达于细胞质中。结论与 RTPCR所示Musashi-1 mRNA表达变化是一致的。见图2。

图2 不同培养条件及5-Fu干预对Musashi-1表达影响的细胞免疫组化

2.6 培养条件及5-Fu干预对人结肠癌细胞克隆形成能力的影响

5-Fu干预前和经5-Fu干预后,SFM组的克隆形成能力分别明显强于SSM组(P<0.01)。SFM组和SSM组的克隆形成能力在5-Fu干预后有所提高(P<0.01)。见表3。

表3 不同培养基及5-Fu干预后的人结肠癌细胞的克隆形成率( ±s)

表3 不同培养基及5-Fu干预后的人结肠癌细胞的克隆形成率( ±s)

与5-Fu干预前SSM组比较,＊＊P<0.01;与5-Fu干预后SSM组比较,##P<0.01;与5-Fu干预前SFM 比较,P<0.01。

组别 克隆形成率/%(n=10)SFM 组 5-Fu干预前 7.21±0.02＊＊5-Fu干预后 15.85±0.14##SSM组 5-Fu干预前 1.53±0.25 5-Fu干预后 6.42±0.15＊＊

3 讨 论

细胞系是经历体外培养获得“永生性”的细胞,在其不断的传代过程中,性质已经发生一定的变化[2];且细胞系这种“永生性”与肿瘤干细胞的特征有异曲同工之处。原代培养细胞离体时间短,性状与体内更接近,基因突变率较细胞系低,更适于研究。这也是本研究再选择原代人结肠癌细胞进一步研究的原因所在。目前分离肿瘤干细胞的方法主要有以下3种:根据细胞表面标记物利用流式细胞仪进行分选、分离获得SP细胞[3-4]及无血清培养肿瘤球形成。

长期干细胞研究中发现,含细胞生长因子的无血清培养基可利于正常干细胞体外扩增,同时可维持干细胞的未分化状态及多向分化潜能。有人将正常脑组织中的神经干细胞在含bFGF和EGF的无血清培养基中培养,发现神经干细胞在含生长因子的无血清培养基中可扩增数量并维持神经干细胞多向分化潜能。将神经胶质瘤[5]、结肠癌[6-7]制成的单细胞悬液置于含 EGF和bFGF的无血清培养基中,少数未分化的肿瘤细胞可形成悬浮细胞球,称为“肿瘤干细胞球”[8]。

本研究即采用含生长因子的无血清培养基(SFM)培养原代人结肠癌细胞,形成细胞球,诸多的研究将此称为肿瘤干细胞球,其中富含肿瘤干细胞。与SSM相比,SFM组中SP细胞比例及CD133+细胞比例较高、Musashi-1的表达较强,且克隆形成能力较强。而 SP细胞、CD133及Musashi-1的表达以及克隆形成能力的检测是目前被广泛用于鉴定结肠癌干细胞功能特征的方法。因此,本研究有理由认为含生长因子的培养基可以成功地富集肿瘤干细胞样细胞群,为进一步研究结肠癌肿瘤干细胞的生物学特征奠定基础。此外,5-Fu对SFM组细胞的抑制率较低,该结果与肿瘤干细胞理论中所提及的肿瘤干细胞可能是化疗耐药的根源所在是一致的[9]。本研究比较了5-Fu干预前后结肠癌细胞中SP细胞比例、CD133及Musashi-1表达及克隆形成能力的改变。结果显示,经5-Fu干预后,无论SSM组还是SFM组,SP细胞比例增加、CD133+细胞数增多、Musashi-1 mRNA的表达增强,SFM 组的克隆形成能力增强。该结果从侧面提示5-Fu可进一步富集结肠癌干细胞,纯化经SFM培养获得结肠癌肿瘤干细胞样细胞群,使其肿瘤干细胞的特征更突出,有利于进一步研究结肠癌干细胞。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J].Nature,1994,367(6464):645.

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