江苏省扬州地区胃癌组织中EB病毒感染与p53蛋白表达的相关性

顾学文,肖 芹,王翠梅,陈月香,张真稳

(扬州大学临床医学院,1.病理科;2.内分泌科,江苏扬州,225001)

Epstein-Barr病毒(EBV)是一种DNA肿瘤病毒,与许多人类恶性肿瘤的发生有密切关系。已经证实其与多种肿瘤的发生有关,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病,以及其他一些器官的淋巴上皮性肿瘤[1]。近年来国内外学者研究显示约10%的胃癌组织EBV阳性,EBV感染与胃癌发生有相关性,但存在地区性差异[2]。胃癌是世界范围内死亡率居第2位的恶性肿瘤,在我国居各类恶性肿瘤之首,其发生和发展涉及多种癌基因和抑癌基因激活和丢失。本研究旨在探讨扬州地区胃癌患者EBV感染与抑癌基因p53表达的相关性,并进一步分析EBV致癌的可能机制,以期为临床对EBV相关胃癌的预防、诊断、治疗提供一定的理论依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

96例胃癌组织为本院2007年1月～12月外科手术切除标本。其中男67例,女29例,年龄28～82岁,中位年龄51岁。其中高分化腺癌28例,中低分化腺癌47例,黏液腺癌 10例,黏液细胞癌11例。

1.2 试剂及实验方法

1.2.1 原位杂交:采用荷兰Pan Path公司生产的EBERl原位杂交试剂盒进行原位杂交:石蜡切片经二甲苯脱蜡,乙醇梯度水化,胃酶消化后,与地高辛标记的EBER1寡核苷酸探针进行变性、杂交反应,洗去剩余探针,用辣根酶标记鼠抗地高辛抗体孵育,DAB液显色,苏木素复染,中性树胶封固,镜检观察。以EB病毒阳性的鼻咽癌组织切片作为阳性对照,以已知EB病毒阳性的鼻咽癌组织切片,将无探针杂交液替代EBER探针作为阴性对照。

1.2.2 免疫组化:全部标本均经10%中性甲醛液固定,石蜡包埋,4 μ m厚连续切片。鼠抗人p53单克隆抗体购自北京中山生物公司,EnVision试剂盒购自DAKO公司。采用免疫组化EnVision两步法,实验步骤按说明书进行,用已知阳性片作阳性对照,以PBS缓冲液取代一抗作阴性对照。

1.2.3 结果判断:原位杂交结果判断:EBER1阳性细胞核呈棕黄色,在核内及核仁中均可见EBER1表达,而EBER1阴性细胞不着色呈苏木素复染的颜色。免疫组化染色结果判断:细胞核中呈现均匀棕黄色颗粒分布判为阳性;选取切片中阳性表达最强的10个视野,根据阳性细胞数量的多少,分成-～ 级,其中-:0;+:1%～25%;

:26%～50%; :51%～75%; :76%～100%。阴性结果不显色,显示复染的蓝色。

2 结 果

2.1 EBERl原位杂交结果

EBERl阳性细胞核呈棕黄色,阳性信号几乎表达在所有癌细胞中,阳性细胞大多为+～ ,而EBERl阴性细胞不着色呈复染的蓝色。96例胃癌癌组织标本中检测到15例EBER1阳性,阳性率为15.6%;15例阳性标本中男12例,女3例;有11例癌间质中有大量淋巴细胞浸润;阳性标本均为腺癌,其中高分化腺癌3例,中、低分化腺癌12例。印戒细胞癌及黏液腺癌未见阳性反应。相应癌旁组织均未检测到EBV感染,2者EBER1阳性率差异有显著性(P<0.05)。提示EBV感染与胃癌的发生有关,癌间质中大量淋巴细胞浸润可能是EB病毒感染的重要病理学特征。见图1。

图1 EB病毒在胃癌组织中弥漫阳性,原位杂交法,DAB显色 (200倍)

2.2 免疫组化染色结果

96例胃癌癌组织标本中p53阳性46例,阳性率 47.9%(46/96),相应癌旁组织均为阴性。胃癌组p53蛋白阳性率明显高于癌旁组织组,两组间有显著性差异(P<0.01)。在15例EBV阳性胃癌(EBVaGC)组织标本中 p53阳性11例,见图 2,阳性率 73.3%(11/15);81例EBV阴性(EBVnGC)组织标本中p53阳性35例,阳性率43.2%(35/81);2组间有显著性差异(P<0.01)。提示 EBV阳性胃癌与p53蛋白表达有相关性。

图2 EBVaGC组织中p53蛋白阳性,EnVision免疫组化法 (200倍)

3 讨 论

胃癌是本地区最常见的恶性肿瘤之一,其发生与演变是一个渐进的过程,涉及多种原癌基因的激活及抑癌基因的失活。EB病毒是与人类密切相关的病毒之一,几乎所有的成人都被其感染过,与人类的许多恶性肿瘤有关[1]。EB病毒感染的细胞可表达EB病毒核抗原(EBNA s)、隐性膜蛋白(LMPs)和小分子non-polyadenylatedRNA s(EBER s)等[3-4]。其中由于EBER1在细胞核中表达丰富而稳定,故是目前广泛应用的检测EB病毒感染的敏感指标,并特别适于检测石蜡包埋的病理切片。自1991年Shibata等[3]首次在胃癌细胞中发现EBV以来,国内外对EBV与胃癌相关研究逐渐增多,国外研究报道胃癌EBV感染检出率7.3%～16.9%[3,5],国内研究报道胃癌感染检出率1.6～20.7%[6],存在明显地区差异。本研究显示本地区96例胃癌组织标本,有15例癌组织EBERl阳性,阳性率为15.6%;而癌旁正常组织无EBERl表达。EBVaBC组织中几乎所有癌细胞均有EBERl表达,并有明显的间质淋巴细胞浸润,均为普通型腺癌,表明感染EBV的瘤细胞为单克隆增生,从而推测EBV感染应发生在胃癌形成早期,提示EBV感染与本地区部分胃癌的发生确实存在密切关系。同时间质内淋巴细胞浸润可能是 EB病毒感染的重要组织学特征之一。

Okano等[7]提出,经过EBER1原位杂交技术证实胃癌细胞存在EBV者定义为EBVaGC。p53基因是一个广谱的抑癌基因,大约50%的人类肿瘤与p53基因的突变、过量表达或杂合性丢失有关。细胞周期失控是肿瘤发生的重要原因,p53基因在控制细胞周期和细胞凋亡的过程中发挥着重要作用。突变型p53基因和蛋白构型发生改变是肿瘤形成的关键。p53基因异常与胃黏膜细胞的癌变过程密切相关[8]。但EBVaGC中EBV与p53的相互作用尚无定论。EBV与癌基因和抑癌基因的相互作用成为EBV相关胃癌(EBVaGC)发生机制的研究热点。癌基因和抑癌基因功能变化在EBVaGC发生发展中所起作用因EBV的参与而与其在EBV阴性胃癌(EBVnGC)中的作用有所不同[9],国内学者高瑞萍等[10]采用PCRSSCP技术对胃癌组织标本p53基因外显子5-8的突变情况进行检测,发现EBV阳性组p53基因突变率高于EBV阴性组,认为EBV感染可能促进了p53基因的突变和积累。李淑英等[11]报道EBV感染可能与p53基因表达呈正相关。Luo等[12]研究提出p53蛋白在瘤细胞中的累积可能是p53基因突变引起,也可能是野生型p53与EBV蛋白相互作用的结果。本研究,15例EBV阳性组中有11例p53蛋白阳性表达,其阳性率为73.3%,EBV阴性组中 p53蛋白阳性率为43.2%,EBV阳性组p53蛋白表达阳性率显著高于EBV阴性组,提示EBV感染与p53蛋白在胃癌中过表达有明显关系,可能对胃癌的发展起促进作用。

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[7]Okano M,Gross T G.Acute or Chronic Life-Threatening Diseases Associated With Epstein-Barr VirusInfection[J].Am J Med Sci,2011.[Epub ahead of print]

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