非清髓同种异基因小鼠外周血造血干细胞移植模型的建立及其相关研究

张 琰,孙 宁,汤唯艳,朱华云,刘雅恬,赵 刚,吴剑秋

(1.江苏省肿瘤医院内科,江苏南京,210000;2.东南大学附属中大医院血液科,江苏南京,210009)

非清髓异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)以相对较低的预处理强度,借助形成混合嵌合体(MC)共刺激达到双向耐受,明显降低了移植相关并发症及死亡率,但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后肿瘤复发是影响患者存活率的主要障碍[1]。混合嵌合状态下的移植物抗白血病(GVL)效应相对较弱,使得移植后复发率进一步升高。如何在提高嵌合率的同时降低宿主的GVHD发病率是目前移植研究领域的主要课题。近年来有报道将骨髓干细胞直接注入骨髓腔内明显促进了造血重建,同时降低了GVHD的发病率。本研究选用了H-2不同的2种品系近交小鼠,通过不同途径给予非清髓allo-PBSCT,并在此基础上进行淋巴细胞输注(DLI),比较经尾静脉与髓腔内注射的不同输注PBSCT对小鼠嵌合率及GVHD发病率的影响,并对其可能机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性清洁级BALB/c(H-2d,简称BA)作为供体鼠,雌性清洁级C57BL/6(H-2b,简称B6)小鼠作为受体鼠,6～8周龄,体质量(15.6±1.8)g;由南京大学医学院提供,SPF级动物房内饲养。

1.2 BALB/c小鼠的动员及细胞悬液制备

第4天起皮下注射200 μ g/kg重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF,100 μ g/支,齐鲁制药有限公司生产),1次/d,末次注射2～3 h后无菌条件下取静脉血(EDTA抗凝)并分离脾脏,脾脏剪碎、研磨后制备成脾细胞悬液。分别加入淋巴细胞分离液,以2 000 r/min 300 g离心30 min,分离出单个核细胞(MNC),加入 PBS液(0.01 mmol/L)漂洗2次,调节重悬细胞密度至6×107个/mL。

1.3 移植模型的建立及供鼠淋巴细胞输注

第6天起对受鼠进行肠道准备,饮用水中加入庆大霉素(320 mg/L)和红霉素(250 mg/L),直至移植完成后第3周。d0用特制塑料盒(清洁级包装)装入受体鼠,60Co远距离治疗机给予5.5 Gy60Coγ全身放射治疗(TBI),照射结束4 h内分别经尾静脉及骨髓腔内输注3×107个供鼠的外周血单个核细胞(PBMNC),d+2腹腔内注射CTX 200 mg/kg。供鼠淋巴细胞5×106个经尾静脉回输至受鼠体内。实验共分为5组:①尾静脉外周造血干细胞输注(IV-PBSCT)组(A,n=8):经尾静脉干细胞移植;②髓腔内外周造血干细胞输注(IBM-PBSCT)组预处理对照组(B,n=8):经骨髓腔内干细胞移植;③尾静脉外周造血干细胞输注-供者淋巴细胞输注(IV-PBSCT-DLI)组(C,n=8):尾静脉干细胞移植后输注供鼠淋巴细胞;④髓腔内外周造血干细胞输注-供者淋巴细胞输注(IBM-PBSCT-DLI)组(D,n=8):骨髓腔内干细胞移植后输注供鼠淋巴细胞;⑤对照组(E,n=8):仅给予 TBI+CTX。所有实验分组均未予GVHD预防性治疗。

1.4 嵌合体检测

第7天取静脉血 500 μ L,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,提取基因组DNA(DNA全血样本抽提试剂盒,荷兰QIAGEN公司产品),终浓度为0.5 μ g/L,进行PCR扩增。SRY 引物(南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成)序列:5′-TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG-3′(上游),5′-GATGGCATGTGGGT TCCTGTCC-3′(下游),目的基因296 bp。体系:5×PCR缓冲液 20 μ L,50 mmol/L mgCl2 2.5 μ L,dNTPs 2 μ L,100 μ mol/L上游及下游引物各0.1 μ L,DNA模板4 μ L,TaqDNA 聚合酶 1.0 U,补足体系至100 μ L。扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性60 s,60℃退火60 s,72℃延伸60 s,共循环40次,72℃再延伸10 min。3%琼脂糖凝胶电泳后,利用Image Master VDS凝胶扫描仪成像并进行图像的半定量分析,所有B6小鼠扩增产物的嵌合率以(B6/BA)%来表示。

1.5 一般情况观察

每日记录小鼠的毛发、体位、体型、有无腹泻等,体重每3天称量记录,记录小鼠存活情况;将死亡后小鼠的脾脏、肝脏及小肠取材后固定保存(10%甲醛),集中进行常规病理检测判断GVHD。将小鼠出现精神不振、食纳下降、翘毛、弓背及体重骤降等表现定义为GVHD症状。

1.6 流式检测CD4+CD25+及CD4+/CD8+细胞比例

各实验组及正常B6小鼠在d28处死后取脾脏,制备脾细胞悬液后取100 μ L。设立试验管及对照管,试验管中均加入单克隆荧光抗体小鼠FITC-CD4、PE-CY5-CD8,PE-CD25单抗(美国eBioscience公司产品)20 μ L,阴性对照管中加入相应的同型对照阴性抗体FITC-IgG2b、PECY5-IgG2a、PE-IgG1(美国 eBioscience公司产品)。每份脾细胞悬液分别加入试验管及对照管各50 μ L,室温静置孵育 10 min,加入溶血剂,室温放置5～10 min后,再加入2 mL蒸馏水放置10 min至透明,1 500 r/min离心5 min,弃去上清后加入500 μ LPBS后上机检测。以阴性对照管射门参数检测CD4+、CD8+及CD4+CD25+细胞数。

2 结 果

2.1 嵌合状态

第7天除预处理对照E组雌性B6小鼠外,其余各组均在DNA水平上检测到雄性供鼠的SRY基因。经半定量分析,各组平均嵌合率为:A组(32.76±3.69)%,B组(58.29±5.37)%,C组(53.16±6.39)%,D组(87.51±9.82)%。各组小鼠均形成了混合嵌合体,B组嵌合率明显高于A组,差异具有统计学意义(P<0.05),DLI后嵌合率均有所上升,D组嵌合率的增高水平明显高于C组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 小鼠生存状态

各移植组部分小鼠d+5开始出现不同程度的GVHD表现,以C组小鼠GVHD症状较为严重并于第9天开始出现死亡,A组次之,B、D 2组均未见明显的GVHD表现。其中A组死亡1只,C组死亡3只,B、D组死亡1只。E组小鼠d3起出现精神不振,食纳减少,体重略有下降,第7天开始恢复,后期2只死于感染,1只死于意外。

2.3 病理检查结果

①脾脏萎缩,正常结构破坏,大量巨噬细胞和淋巴细胞浸润;②肝细胞不同程度变性坏死,中央静脉及肝血窦扩张、淤血,广泛的淋巴细胞浸润;③小肠黏膜水肿充血,绒毛坏死脱落,黏膜下层淋巴细胞浸润。各组死亡小鼠的病理检查符合GVHD表现,其改变基本相同。

2.4 T淋巴细胞亚群

C组CD4+CD25+占脾淋巴细胞比例明显降低,B、D 2组CD4+CD25+占脾淋巴细胞比例则明显升高,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。移植后各组小鼠的CD4+/CD8+比值均较预处理对照组升高,接近正常对照组。见表1。

表1 小鼠流式细胞术检测CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+占脾淋巴细胞比例( ±s)

表1 小鼠流式细胞术检测CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+占脾淋巴细胞比例( ±s)

与正常对照组比较,＊P<0.05

T淋巴细胞 正常对照 A组 B组 C组 D组 E组CD4+/CD8+ 1.792±0.078 1.506±0.042＊ 1.753±0.065 1.319±0.092＊ 1.704±0.087 1.453±0.068＊CD4+CD25+比例 15.62% 12.28% 28.73%＊ 8.06%＊ 25.64%＊ 14.75%

3 讨 论

造血干细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞,具有自我更新及分化成熟为各种血细胞和免疫活性细胞的能力,不仅重建了患者的造血功能,亦重建了患者的免疫功能。近期大量研究表明通过髓腔内注射的方式有效的促进骨髓干细胞的归巢、迅速重建骨髓造血以机体免疫功能,在诱导免疫耐受的同时降低了GVHD的发病率[2-4]。本实验选取H-2差异的近交系小鼠,在TBI联合CTX的非清髓性预处理方案后分别经尾静脉及骨髓腔两种途径进行外周造血干细胞移植,并在此基础上给予DLI。嵌合体检测结果显示髓腔内输注外周造血干细胞组C57BL/6(H-2b)受鼠第7天的嵌合率达58%,显著优于经尾静脉输注组,在其基础上的IBM-PBSCTDLI组嵌合率高达87.5%同时降低了GVHD的发病率。髓腔内注射避免了造血干细胞在受者血循环中的损耗,简化了干细胞的归巢过程,同时相对大量的干细胞增加了归巢的竞争能力。经GCSF动员后不但明显增加了CD34+干细胞的数量,也使CD3+细胞数量增加近3倍,并对细胞因子的表达有着重要影响,包括增加白介素-10、转化生长因子-β和IFN-α的水平[5]。这些因素共同促进了供者细胞的嵌合,显著促进了骨髓造血修复。通过髓腔内注射外周造血干细胞成功构建了小鼠移植模型,并未进一步研究DLI在移植后的作用创造了条件。

流式细胞术检测T细胞亚群是评价移植术后免疫状态的常用方法。经亚致死剂量照射后小鼠的淋巴细胞一般在30 d后开始恢复,逐渐达正常水平。CD4+CD25+Treg作为抑制性T细胞的一种功能亚群,在机体的抗肿瘤免疫的重要组成部分,近年来的许多实验研究证实调节性T细胞在移植免疫中同样发挥了重要作用。无论是人类白细胞抗原(HLA)全相合或半相合外周造血干细胞移植还是移植后的DLI,高水平的调节性T细胞均明显移植了急性GVHD的发生,同时促进了移植早期的免疫重建[6-7]。Kim等[8]报道在慢性GVHD状态下去除CD4+CD25+Treg,不但诱导了急性GVHD的出现,同时促进了CD8+T细胞的扩增。本实验中第28天进行流式细胞术检测,CD4+CD25+Treg在IV-PBSCT-DLI组中比例明显降低,而IBM-PBCST及IBM-PBSCT-DLI组均显著升高,推测CD4+CD25+T reg可能与IBM-PBSCT/DLI降低了GVHD发病率相关,而其对于CD8+T细胞可能存在一种优先抑制作用,进而导致了相应的CD4+/CD8+比值的改变。但CD4+CD25+Treg本身的免疫抑制功能是否会影响GVL效应仍需进一步探讨。

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