双花提取物抗糖尿病的作用研究

巫冠中，冯 玥

（中国药科大学 药理教研室，江苏 南京210009）

糖尿病（Diabetes Mellitus）是一种多病因的代谢疾病，以慢性高血糖为主要特征，伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。其中以2型糖尿病最为常见，占糖尿病人总数的90%以上［1］。糖尿病常引起心血管病变、视网膜病变等多种并发症，死亡率逐年上升［2］，因此研发有效防治糖尿病及其并发症的药物成为人们的迫切需求。中药防治糖尿病有悠久的历史，近年来已分离出许多药效良好的活性成分，黄酮类化合物已被证实具有降低血糖、血脂，改善糖耐量等作用［3］，而月季花（Rosa chinensis）和玫瑰花（Rosa rugosa）含有多种黄酮类物质［4－5］，具有抗氧化［6］、降糖［7］及减肥作用等［8］。基于月季和玫瑰的药理作用，将这两种同属蔷薇科的植物按比例混合，利用体内外试验综合观察其对糖尿病糖、脂代谢的调控作用，并探究可能的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动物及饲料

清洁级SD大鼠，雄性，160～180g，购自浙江省实验动物 中 心，合 格 证 号：SCXK（苏 ）2008－0033；饲 养 温 度（22±2）℃，照明时间12h／d。普通饲料（南京市青龙山动物饲养场），高脂饲料由70%基础饲料、10%猪油、10%蔗糖、10%全蛋粉混合加工而成，由青龙山动物饲养场制作。

1.2 双花提取物

月季花和玫瑰花购自安徽神州医药公司，15℃～20℃自然晾干，两种花等比例混合后80℃水提2次，第一次料液比1∶12，60min；第二次料液比1∶8，30min。提取液经DM301大孔树脂吸附纯化后，用40%乙醇洗脱，洗脱物75℃真空干燥得最终双花提取物。测得提取物总黄酮含量约45%～51%，经HPLC检测主要含柚皮素、紫云英苷、槲皮素等黄酮类物质。

1.3 仪器和设备

752N分光光度仪（上海菁华科技）；LS－1F型超净工作台（上海索普仪器）；YCP－200型CO2细胞培养箱（上海易亮医疗器械）；XDS－1B倒置显微镜（OlymPus）；放射免疫γ计数器（DFM－96型16管手动）。

1.4 药品及试剂

吡格列酮、格列美脲（上海兰生股份有限公司），STZ（Sigma）；葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白试剂盒（上海科欣生物技术研究所）；胰岛素、胰高血糖素试剂盒（中生北控生物技术有限公司）；糖化血清蛋白、丙二醛试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM培养基（Gibco），HEPES（Merk），胰蛋白酶（1∶250）（AMRESCO），96孔培养板（Costar），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），其他试剂均为市售分析纯。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立

参照文献［9－10］设计，略有改进。SD大鼠65只，普通饲料适应性喂养一周后按体重随机分为7组，一组为正常对照组（n＝9），常规饲料喂养，其余6组喂高脂饲料，诱导胰岛素抵抗。4周后，将高脂饲料喂养的大鼠禁食12h，腹腔注射用柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液新鲜配制的STZ（剂量35mg／kg，体积0.2mL／100g），5天后禁食12h监测空腹血糖，次日第二次腹腔注射同剂量STZ。第二次注射STZ 5天后，测各组空腹血糖，血糖值大于11.1mmol／L视为造模成功。

2.2 分组与给药

将造模成功的52只大鼠，按血糖值随机分为6组，模型对照组9只，双花提取物高、中、低剂量组（分别为50mg／kg、25mg／kg、12.5mg／kg）各9只，吡格列酮组（10mg／kg）、格列美脲组（10mg／kg）各8只。各组药物均用0.1%CMCNa混悬，每天一次灌胃给药，共给药5周。除正常对照组外，其他各组继续高脂饲料喂养。

2.3 口服糖耐量（OGTT）的测定

各组灌胃给药2周后禁食12h，按各自剂量灌胃给药的同时灌胃2g／kg葡萄糖，分别在给药前（0h）及给药后0.5h，1h，2h，4h眼眶采血，分离血清后用葡萄糖试剂盒测定血糖值。

2.4 血清中各指标的测定

各组连续灌胃给药5周，末次给药后禁食12h，麻醉后股静脉放血并处死，分离血清同时取心脏、肝脏和肾脏，－20℃保存待测。血清中 TC，TG，HDL－C，LDL－C，FBG，GSP，Ins，Glu含量均用试剂盒测定，其中胰岛素及胰高血糖素用放免法测定。

2.5 各脏器MDA的测定

各组心脏、肝脏和肾脏室温解冻后，称取0.2g用冰冷生理盐水冲洗，剪碎加入生理盐水冰水浴匀浆制备匀浆液，4 000r／min离心10min，取上清液测MDA。

2.6 HePG2葡萄糖消耗的测定

2.6.1 细胞株及培养

人肝癌细胞株HePG2购于中科院上海细胞所，接种于含10%小牛血清的中糖DMEM培养基中（含葡萄糖11.1 mmol／L，补充青霉素、链霉素各100U／L），置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。HePG2细胞呈贴壁生长，0.25%胰酶消化，每3天按1∶3的比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。试验时将细胞悬液以1.5×105的密度接种于96孔培养板中，置培养箱中培养使之形成单层贴壁细胞。

2.6.2 葡萄糖消耗实验

接种24h后细胞已完全贴壁形成单层细胞层，吸掉培养液，用PBS冲洗2次，然后各孔加入终浓度为0.022mg／mL、0.067mg／mL、0.200mg／mL、0.600mg／mL的双花提取物（不同质量的提取物溶解在含11.1mmol／L葡萄糖的DMEM中过滤而成），同时设立正常细胞对照组和无细胞培养液对照组（即空白孔）。在培养箱中孵育24h后将培养液移出用葡萄糖试剂盒测葡萄糖含量。用各组空白孔含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是24h各孔细胞的葡萄糖消耗量。板中下层细胞用200g／L KOH裂解，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 提取物对2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影响

由表1可见，各组血糖峰值出现在糖负荷后1h，模型组各时间点的血糖值较正常组都有显著提高（P＜0.01），可见糖耐量严重受损。提取物高、中剂量组与模型组比较，可显著降低糖负荷后的血糖峰值（P＜0.05），显著缩小曲线下面积AUC（P＜0.01，P＜0.05），改善糖负荷后的血糖波动，作用优于阳性药。

3.2 提取物对2型糖尿病大鼠血清TC，TG，HDL－C，LDL－C的影响

高脂饲料喂养并灌胃给药5周后，模型组TC，TG，HDL－C，LDL－C水平明显高于正常对照及其他给药组（见表2），其中提取物高剂量组可显著降低TC，TG，LDL－C（P＜0.01），与阳性药作用相近，同时显著升高 HDL－C（P＜0.01），此方面作用强于阳性药。提取物中、低剂量作用减弱，体现了剂量相关性。

表1 双花提取物对2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影响（s）

表1 双花提取物对2型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的影响（s）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 剂量（mg／kg）n 灌胃给药后时间（h）0 0.5 1 2 4 AUC（mM×h）正常组 9 5.13±1.07 6.08±1.33 7.32±1.94 5.72±1.09 4.11.91±2.49 77.92±7.28 94±1.34 23.34±4.00模型组 9 13.52±2.51＃＃ 27.62±2.86＃＃ 30.74±3.45＃＃ 26.38±2.42＃＃ 14.11±2.75＃＃ 93.92±9.70＃＃花高组 50 9 10.87±1.97 20.40±2.67＊ 23.27±2.33＊ 18.75±2.93＊＊ 10.62±2.56 69.11±5.96＊＊花中组 25 9 11.76±2.35 22.45±2.39＊ 24.42±2.79＊ 19.98±2.58＊ 11.34±2.25 73.79±3.58＊花低组 12.5 9 10.94±2.77 24.87±2.62 28.22±3.27 22.64±2.41 11.23±2.62 81.52±10.52匹格列酮 10 8 11.64±2.4 22.38±2.38＊ 25.35±3.05 20.00±2.52＊ 9.95±2.41 73.06±7.10＊格列美脲 10 8 11.48±2.04 23.86±2.46 26.94±2.91 20.68±2.47＊

表2 双花提取物对2型糖尿病大鼠血脂各项的影响（s）

表2 双花提取物对2型糖尿病大鼠血脂各项的影响（s）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 剂量（mg／kg）TC（mM）TG（mM）HDL－C（mM）LDL－C（mM）正常组 1.73±0.33 0.65±0.28 1.43±0.22 0.21±0.08模型组 2.75±0.32＃＃1.16±0.29＃＃1.29±0.24 1.38±0.39＃＃花高组 50 2.31±0.3＊＊ 0.75±0.07＊＊1.84±0.31＊＊0.38±0.12＊＊花中组 25 2.43±0.27＊ 0.93±0.28 1.79±0.33＊＊0.47±0.19＊花低组 12.5 2.5±0.32 0.99±0.24 1.68±0.33＊ 0.71±0.22匹格列酮 10 2.01±0.37＊＊0.79±0.34＊ 1.58±0.29＊ 0.39±0.17＊格列美脲 10 1.9±0.35＊＊ 0.82±0.14＊ 1.49±0.25 0.36±0.10＊＊

3.3 提取物对2型糖尿病大鼠血清FBG，GSP，Ins，Glu的影响

表3可见，与模型组比较提取物可显著降低糖尿病大鼠FBG、GSP，并呈现剂量相关性；模型组Ins、Glu较正常组显著升高（P＜0.01），说明胰岛素抵抗已形成，提取物高、中剂量能显著降低血清中Ins、Glu（P＜0.01，P＜0.05），其中高剂量与阳性药比较无显著性差异。

表3 双花提取物对2型糖尿病大鼠血清各指标的影响（s）

表3 双花提取物对2型糖尿病大鼠血清各指标的影响（s）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

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3.4 提取物对2型糖尿病大鼠各脏器MDA的影响

由表4可见，提取物及阳性药降低MDA的作用只在肾脏较为显著，肝脏及心脏MDA值也略有下降，但与模型组比较无显著性差异。

3.5 提取物对HePG2细胞葡萄糖消耗的影响

图1显示，提取物可显著增加HePG2细胞葡萄糖消耗量，并呈现剂量相关性，与不含药的对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。

表4 双花提取物对2型糖尿病大鼠各脏器MDA的影响（s）

表4 双花提取物对2型糖尿病大鼠各脏器MDA的影响（s）

注：与正常组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 剂量2.18±0.39（mg／kg）n MDA（nmol／mg Pro）9 1.78±0.26 1.23±0.16 1.84±0.22模型组 9 2.38±0.34＃ 2.02±0.35＃＃ 2.3±0.33＃花高组 50 9 2.15±0.21 1.49±0.29＊ 2.19±0.3花中组 25 9 2.42±0.33 1.58±0.26＊ 2.33±0.22花低组 12.5 9 2.65±0.36 1.73±0.25 2.45±0.23匹格列酮 10 8 2.17±0.28 1.58±0.38＊ 2.17±0.33格列美脲 10 8 2.13±0.2 1.42±0.25＊＊肝脏 肾脏 心脏正常组

图1 双花提取物对HepG2葡萄糖消耗的影响

4 讨论

2型糖尿病除先天因素外，后天不合理的饮食习惯是重要的诱因之一，常并发血脂代谢异常。而胰岛素与其受体结合所产生的一系列反应是调节脂代谢的重要因素［11］，当胰岛素分泌障碍或功能性障碍均会导致体内脂代谢异常，引发多种物质代谢异常的发生、发展。本实验结果表明，双花提取物可显著降低FBG，改善葡萄糖耐量，使糖负荷的血糖峰值显著降低，曲线下面积减小，从而抑制血糖波动。而餐后血糖的较大波动是引起糖尿病并发症的重要原因［12］，由此可见，双花提取物对预防糖尿病并发症有益。GSP作为糖尿病近期内控制的一个灵敏指标，可反应2～3周前的血糖控制水平［13］。双花提取物可显著降低GSP，与阳性药作用相当，且显著降低 TG，TC，LDL－C，对升高 HDL－C的作用尤为显著，从而改善脂质代谢紊乱。本试验还表明，双花提取物的确可显著鹌鹑高脂诱导的大动脉粥样硬化斑块（数据未列出）。胰岛素抵抗阶段，胰岛β细胞通过增加胰岛素的分泌使血糖维持在较低水平，可表现为胰岛素水平的升高。相对于模型组大鼠胰岛素水平，双花提取物组胰岛素和胰高血糖素水平均较低，表明它通过调节两种激素的分泌控制血糖。糖尿病引起体内不同程度的氧化损伤，MDA作为氧自由基作用于脂质产物，反应氧自由基在体内的损伤程度。除肾脏外，双花提取物对糖尿病大鼠其它脏器MDA的影响较小，抗氧化作用较弱。双花提取物显著增加HePG2葡萄糖消耗量，增加肝脏对葡萄糖的利用而降低血糖。由此，双花提取物抗糖尿病作用可能与以下因素有关：①改善糖耐量，降低血胰岛素和胰高血糖素，从而改善胰岛素抵抗，减小餐后血糖波动；②增加肝脏对糖的消耗利用，减少肝糖的输出；③降低TG，TC，LDL－C，升高 HDL－C，从而改善脂代谢紊乱，抑制糖尿病并发症的发生。

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