豫南地区汉族人群类风湿性关节炎患者TNF-α基因启动子－308 G/A多态性检测*

宋新强，汪学群，易朝辉，郑 健，韩俊刚，刘承丽，张亚可，彭玉玲，马 云

1)信阳师范学院生命科学学院信阳464000 2)信阳市第一人民医院风湿免疫科信阳464000 3)信阳职业技术学院信阳464000

(2010-11-28收稿 责任编辑 赵秋民)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未完全明确，遗传和环境因素都有可能导致该病的发生与发展［1］。一部分遗传因素来自于人类主要组织相容性复合体(HLA)Ⅱ类基因，也有研究［2］表明，HLAⅢ类基因的一些区域也与RA的易感性有关。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因位于 HLAⅢ类基因区，由4个外显子和3个内含子组成，含有许多多态性位点，包括微卫星DNA和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。到目前为止，已经发现有 14个 SNP位点(－1031 T/C，－863 C/A，－857 C/T，－851 C/T，－419 G/C，－376 G/A，－308 G/A，－244 G/A，－238 G/A，－163 G/A，－49 G/A，+489 G/A，+851 A/G，+1304 A/G)和6个微卫星位点［3］。目前，已有关于TNF-α基因SNPs与RA的相关性研究，但是，很多结论却完全相反［4-7］。作者以豫南地区人群作为研究对象，分析TNF-α基因启动子－308 G/A多态性与RA发生、发展之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 RA组90例，其中女60例，男30例，均为汉族，年龄 18 ～75(33.5 ±3.2)岁，为信阳市第一人民医院2008年至2010年住院及门诊确诊的患者，病程5个月～15 a。诊断符合美国风湿病协会(ACR)1987年诊断标准，其中无侵蚀性病变者32例，有侵蚀性病变者58例。正常对照100例，女60例，男40例，均为汉族，年龄18～60(34.2±4.6)岁，为信阳师范学院校医院门诊体检健康者。

1.2 标本采集及基因组DNA的提取 抽取受试者外周血2 mL，加EDTA抗凝后－20℃冰冻保存。用酚/氯仿抽提法提取基因组 DNA，其 A(260nm)/A(280nm)为1.6 ～1.8，使用时 DNA 终质量浓度为100～300 μg/L。

1.3 TNF-α－308 G/A 的PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析 根据文献［8］设计引物，上游引物序列:5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’，下游引物序列:5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’。PCR反应体系(50μL):10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶 0.25 μL，模板 DNA 8 μL，引物各1μL，双蒸水30.75μL。PCR反应条件:94℃预变性4 min;94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，循环30次;72℃延伸5 min。取PCR产物13 μL，加10×Buffer 2 μL，NcoⅠ酶1 μL，100 mg/L牛血清白蛋白2μL，双蒸水2μL，总体积20μL，37℃过夜(12 h)。酶切产物采用25 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果用凝胶分析系统分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析，应用χ2拟合优度检验检测RA组与对照组基因型频率的分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡。用χ2检验、精确概率法或校正χ2检验比较2组基因型频率和等位基因频率以及有无侵蚀性病变患者等位基因的分布，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(CI)表示相对风险度。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 正常对照组TNF-α 基因启动子(χ2=6.750，P=0.009)和 RA 组－308 位点(χ2=19.401，P ＜0.001)基因型频率均不符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 TNF-α基因启动子 －308 G/A PCR-RFLP 结果 TNF-α基因启动子－308位点检出3种基因型，酶切产物分别包含87、20 bp 2条条带GG型，107、87、20 bp 3条条带(GA型)和仅有107 bp条带(AA型)。见图1。2组基因型及等位基因频率的比较见表1。RA组有、无侵蚀性病变患者间TNF-α基因启动子－308位点等位基因频率比较，见表2。

图1 NcoⅠ酶切 TNF-α基因启动子－308位点PCR扩增产物1，4:GA型;2:GG型;3:AA型。

表1 RA组与正常对照组TNF-α基因启动子－308位点基因型和等位基因频率 例(%)

表2 RA组有、无侵蚀性病变患者TNF-α基因启动子－308位点等位基因频率分布 例(%)

3 讨论

实验［9］表明，在RA患者血清和滑膜液中都能检测到TNF-α与白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-13、IL-15、IL-17、TGF-β 等，提示细胞因子参与了RA的发病过程。动物实验［10-11］也暗示，TNF-α的高表达加快了RA的发病过程。

有研究［4］结果显示RA的易感性与TNF-α启动子－308位点A等位基因有关，另有研究［5］显示RA与G等位基因有关，或者两者都与RA无关［6-7］。作者的实验结果显示豫南地区汉族人群TNF-α基因启动子－308位点G/A多态性与RA发病无关，但与RA的疾病发展程度相关。Cvetkovic等［9］的实验表明，在伊朗东北部城市麦什德，TNF-α基因启动子－308位点GA杂合子患者更易发生RA;Wilson等［4］的实验也表明，在荷兰的奈梅亨GA基因型更易发展为侵蚀型RA;而Brinkman等［5］报道称，在荷兰西部城市莱顿未发现－308位点GA型与RA的疾病发展程度相关，却发现－238 GG型与RA疾病发展程度相关。作者的实验结果显示，TNF-α基因启动子－308位点G等位基因与RA的严重程度有关。

综上所述，TNF-α基因启动子－308 G/A多态性可能与豫南地区汉族人群RA无关，但可能与关节的侵蚀性病变有关。

［1］刘红春，魏爱卿，李文胜，等.类风湿性关节炎患者治疗前后血清骨钙素及肿瘤坏死因子水平的变化［J］.郑州大学学报:医学版，2007，42(2):266

［2］ Zanelli E，Jones G，Pascual M，et al.The telomeric part of the HLA region predisposes to rheumatoid arthritis independently of the classⅡloci［J］.Hum Immunol，2001，62(1):75

［3］ Hajeer AH，Hutchinson IV.Influence of TNF-alpha gene polymorphisms on TNF-alpha production and disease［J］.Hum Immunol，2001，62(11):1191

［4］ Wilson AG，de Vries N，van de Putte LB，et al.A tumour necrosis factor alpha polymorphism is not associated with rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，1995，54(7):601

［5］ Brinkman BM，Huizinga TW，Kurban SS，et al.Tumour necrosis factor alpha gene polymorphisms in rheumatoid arthritis:association with susceptibility to or severity of disease?［J］.Br JRheumatol，1997，36(5):516

［6］ Rodriguez-Carreon AA，Zuniga J，Hernandez-Pacheco G，et al.Tumor necrosis factor-alpha －308 promoter polymorphism contributes independently to HLA alleles in the severity of rheumatoid arthritis in Mexicans［J］.J Autoimmu，2005，24(1):63

［7］ Jimenez-Morales S，Velazquez-Cruz R，Ramirez-Bello J，et al.Tumor necrosis factor-alpha is a common genetic risk factor for asthma，juvenile rheumatoid arthritis，and systemic lupus erythematosus in a Mexican pediatric population［J］.Hum Immunol，2009，70(4):251

［8］ Rezaieyazdi Z，Afshari JT，Sandooghi M，et al.Tumour necrosis factor-α －308 promoter polymorphism in patients with rheumatoid arthritis［J］.Rheumatol Int，2007，28(2):189

［9］ Cvetkovic JT，Wallberg-Jonsson S，Stegmayr B，et al.Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of the TNF-alpha，IL-1beta，and IL-1Ra genes［J］.JRheumatol，2002，29(2):212

［10］Furst DE.Development of TNF inhibitor therapies for the treatment of rheumatoid arthritis［J］.Clin Exp Rheumatol，2010，28(3 Suppl 59):S5

［11］Xinqiang S，Fei L，Nan L，et al.Therapeutic efficacy of experimental rheumatoid arthritis with low-dose methotrexate by increasing partially CD4+CD25+Treg cells and inducing Th1 to Th2 shift in both cells and cytokines［J］.Biomed Pharmacother，2010，64(7):463