地塞米松和1，25-(OH)2 D3对EC1细胞增殖和细胞周期的影响*

张 震，付 聪，王冰一，窦蒙蒙，赵继敏，黄幼田，赵明耀#

1)郑州大学临床医学系郑州450001 2)郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州450001

(2010-12-31收稿 责任编辑 李沛寰)

地塞米松(dexamethasone，DEX)和活性维生素1，25-(OH)2D3是临床和实验中使用的肿瘤诱导分化剂，分属类固醇类激素和非类固醇类激素两大家族，前者的受体是在细胞质内，后者的受体是在细胞核内。它们作为配体在转录因子的基因表达调控上有明显的不同。作者观察了这2种药物单独及联合使用对食管鳞状细胞癌EC1细胞的增殖与细胞周期的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和细胞 RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(天津 TBD 公司)，DEX、1，25-(OH)2D3、RNase、MTT 和 DMSO(美国 Sigma公司)，EC1细胞(郑州大学基础医学院病理生理学教研室惠赠)。DEX和1，25-(OH)2D3均采用无水乙醇溶解，配置成10－4mol/L储存液，使用时用培养液稀释成相应的工作浓度。

1.2 细胞培养和分组 EC1细胞在含体积分数为10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞汇合至70%～80%时，用胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液。①溶剂对照组:体积分数0.1%的无水乙醇作用EC1细胞。②DEX组:用10－7mol/L DEX处理EC1 细胞。③1，25-(OH)2D3组:用 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3处理EC1细胞。④联合用药组:10－7mol/L DEX 和 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3处理 EC1细胞。各组细胞经药物作用48、72和96 h后，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.3 EC1细胞增殖抑制实验 采用MTT法。将制成的单细胞悬液，按1.5×104L－1的密度分别接种到3块96孔培养板中，培养24 h;按1.2分组分别加药处理细胞，每组设3个复孔，再分别培养48、72和96 h;每孔加入5 g/L的MTT溶液20μL，继续培养4 h;吸去上清，加入200μL DMSO，室温下振荡10 min使紫色结晶全部溶解，在96孔酶标仪上以空白对照孔调零，570 nm处读取吸光度(A)值。

1.4 EC1细胞周期检测 应用流式细胞仪法。于3块6孔培养板每孔接种约2.5×105个细胞，无血清培养基培养24 h，弃去无血清培养基，PBS洗2遍，加入新RPMI 1640完全培养基，并进行实验分组，分别作用48、72和96 h。将各组细胞用2 g/L胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清;用PBS洗2遍，离心后弃上清，加入体积分数为70%的冰乙醇固定，4℃过夜;上机前1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS洗3遍;加入1 mL PBS制成细胞悬液，加入5 g/L RNaseA 10μL，室温放置1 h;调整细胞浓度为1×106/管，加入100 mg/L碘化丙啶液50μL，避光30 min，上机每个样本检测10 000个细胞周期的改变，计算处于G0/G1期EC1细胞比率。

1.5 统计学处理 应用SPSS 10.0进行分析。采用2×2×3析因设计的方差分析比较各组EC1细胞增殖与细胞周期的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DEX和1，25-(OH)2D3及联合用药对 EC1细胞形态的影响 与溶剂对照组比较，药物作用96 h后，DEX组、1，25-(OH)2D3组及联合用药组 EC1细胞生长缓慢，均未见细胞死亡现象(图1)。

图1 药物作用96 h各组EC1细胞的形态(×200)A:溶剂对照组;B:DEX组;C:1，25-(OH)2 D3组;D:联合用药组。

2.2 DEX 和1，25-(OH)2D3对 EC1细胞增殖和细胞周期G0/G1期的影响 见表1。

表1 DEX 和1，25-(OH)2D3对 EC1细胞增殖和细胞周期G0/G1期的影响(n=3)

3 讨论

根据肿瘤的正负信号调控理论，细胞癌变是因为调控细胞生长正信号分子过多而负信号分子过少，导致肿瘤细胞出现高增殖、低分化及低凋亡等生物学特征。而肿瘤的诱导分化治疗，是在诱导分化剂的作用下，使肿瘤细胞被诱导，重新向正常细胞方向分化，表现为细胞生长、形态、基因表达和生物标志物接近正常细胞状态。地塞米松通过细胞质内受体发挥作用，体内大多数组织存在地塞米松受体，因此地塞米松的作用非常广泛。临床上应用大剂量的糖皮质激素抗炎、抗过敏、抗免疫排斥反应和抗休克［1］。研究［2-3］表明糖皮质激素与肿瘤有着密切的关系，该激素对肝癌、卵巢癌等肿瘤细胞有抑制增殖和诱导分化作用。1，25-(OH)2D3除了具有钙磷代谢的功能之外，还是一种细胞周期调节剂，影响细胞的增殖、分化和凋亡，在前列腺癌、结肠癌等肿瘤治疗中表现出明确的诱导分化作用［4-5］。

作者采用1，25-(OH)2D3单独或与 DEX联合作用于EC1细胞，均显示对EC1细胞增殖的抑制效果。相关研究［6-9］显示，在细胞内 1，25-(OH)2D3首先与高亲和力的特异性受体VDR发生结合，与配体结合的VDR再与视黄酸X受体形成异源二聚体后，即可与靶基因上游的维生素D反应元件结合形成转录调控复合体，从而激活或抑制下游靶基因的转录、表达，从而调控 p53、pRb、p21、p27等肿瘤相关基因的表达。而糖皮质激素产生的抑制增殖，使细胞周期阻滞在G0/G1期的信号是通过p21/WAF1的表 达 完 成 的［10］。该 研 究 结 果 显 示，1，25-(OH)2D3单独或与DEX联合将EC1细胞周期阻滞于G0/G1期，并且2种药物在这两个作用上具有交互效应，提示这2药可能均通过p21/WAF1而发挥细胞周期G0/G1期阻滞作用。进一步探讨其中机制有助于提高细胞诱导分化剂抗肿瘤效应。

［1］杨国兴，苏永华.糖皮质激素与肿瘤的关系［J］.中国民族民间医药，2009，18(8):3

［2］陈庆强，黄嘉瑜，陈力舟.地塞米松在晚期肝癌中的临床应用［J］.中华现代中西医杂志，2004，2(3):265

［3］徐明娟，方国恩，崔英，等.地塞米松对人卵巢癌细胞糖皮质激素受体的调节［J］.上海医学，2003，26(1):53

［4］辛星，万献尧，毕丽岩.维生素D3及其受体的临床意义［J］.医学与哲学，2010，31(4):44

［5］尹贻贞，刘兆鹏.活性维生素D3的抗肿瘤信号转导作用［J］.生命的化学，2009，29(4):552

［6］ Swami S，Raghavachari N，Muller UR，et al.Vitamin D growth inhibition of breast cancer cells:gene expression patterns assessed by cDNA microarray［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，80(1):49

［7］ Wang QM，Jones JB，Studzinski GP.Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 as a mediator of the G1-S phase block induced by 1，25-dihydroxyvitamin D3 in HL60 cells［J］.Cancer Res，1996，56(2):264

［8］ Liu M，Lee MH，Cohen M，et al.Transcription activation of the Cdk inhibitor p21 by vitamin D3 leads to the induced differentiation of the myelomonocytic cell line U937［J］.Genes Dev，1996，10(2):142

［9］ van den Bemd GJ，Pols HA，van Leeuwen JP.Antitumor effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 and vitamin D3 analogs［J］.Curr Pharm Des，2000，6(7):717

［10］Park JH，Oh EJ，Choi YH，et al.Synergistic effects of dexamethasone and genistein on the expression of Cdk inhibitor p21WAF1/CIP1 in human hepatocellular and colorectal carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2001，18(5):997