重组人生长激素对人巨噬细胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α的影响*

丁培杰，段长恩，张世杰，赵国强

1)漯河医学高等专科学校免疫学教研室漯河462000 2)新乡医学院免疫学教研室新乡453003 3)郑州大学第一附属医院检验科郑州450052 4)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001

(2010-06-11收稿 责任编辑 徐春燕)

生长激素(growth hormone，GH)是由脑垂体前叶的腺细胞分泌的一种蛋白质，其主要作用是促进生长发育和影响代谢，既往主要用于儿童GH缺乏症的治疗。近年来发现GH具有广泛的生理作用，其免疫调节作用为人们广泛关注［1］。已有研究［2-3］显示GH对T淋巴细胞有重要的调节作用。作者从人静脉血中分离单个核细胞，将其诱导分化为巨噬细胞，观察不同质量浓度的人重组GH(rhGH)对于人巨噬细胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI 1640培养基、胎牛血清(天津TBD公司)，重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rh-GM-CSF，Peprotech 公司)，CD14-FITC、TLR4-PE 及同型对照(深圳晶美生物工程有限公司)，脂多糖(LPS，上海BOYUN公司)。

1.2 巨噬细胞的诱导与鉴定［4］取健康人静脉血，肝素抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(含终浓度1 000 U/mL rhGM-CSF)培养6 d。观察贴壁细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面CD14和TLR4的表达。

1.3 细胞分组与处理 将1.2中所获得的细胞分为6组，分别加入终质量浓度为1、4、20和50μg/L的rhGH，LPS组加入的终质量浓度为1 mg/L的LPS，空白对照组仅给予RPMI 1640培养液。

1.4 细胞培养上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平测定 于培养4、8、12 h分别吸取培养上清液50 μL，以ELISA法测定各培养上清液中IL-6、IL-1和TNF-α的水平(每组的不同时间点均设3个复孔)。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析，应用重复测量数据的方差分析观察6组细胞培养不同时间培养上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 巨噬细胞的鉴定 显微镜下观察细胞，可见贴壁细胞伸展，牢固黏附，体积明显增大，从不规则形逐渐变成椭圆形，呈煎蛋状，少数呈长梭形。细胞间可有部分融合，细胞周边或两极可见板状伪足和突起，细胞无明显增殖。所诱导的细胞较为一致地表达CD14和TLR4，流式细胞术检测显示 CD14和TLR4的细胞阳性率达85.1%。

2.2 6组巨噬细胞培养上清液中 IL-1、IL-6和TNF-α水平比较 见表1。

表1 6组巨噬细胞培养上清液中IL-1、IL-6和TNF-α水平比较(n=3)

3 讨论

该研究选用人外周血单个核细胞作为巨噬细胞的来源，与动物实验相比更接近人体功能。单个核细胞具有不同的分化潜能，在不同的培养条件下可向巨噬细胞或树突状细胞分化。GM-CSF在体外可诱导单个核细胞分化为巨噬细胞［5-6］。巨噬细胞的鉴定指标主要包括形态学检查、生物学功能检查和免疫学标志检查等。CD14和TLR4是单核巨噬细胞系统特征性的表面标记。流式细胞术检测结果显示CD14和TLR4的细胞阳性率为85.1%，证明该法培养的巨噬细胞在体外具有生物学活性，且纯度较高。

rhGH是近年来利用重组DNA技术合成的GH，已在临床上得到广泛应用，其具有增强机体免疫力的作用，在体内和体外均能促进胸腺基质细胞分泌胸腺素［7］，在体外能促进植物血凝素刺激的正常人T淋巴细胞的增殖，在体内能提高自然杀伤细胞的活性［8］。

LPS是公认的体内巨噬细胞产生促炎因子的始动者，可以诱导巨噬细胞细胞因子的分泌增加［9］。该研究结果显示LPS刺激巨噬细胞可以显著升高IL-1、IL-6及TNF-α等促炎症细胞因子的分泌，其机制应该与LPS和巨噬细胞表面的TLR4结合从而激活细胞内的信号转导通路，使细胞因子的分泌增加有关［10］。rhGH同样可以促进巨噬细胞上述细胞因子的分泌，且随培养时间的延长呈升高的趋势，可视为宿主对外来病原体的一种防御反应;当达到一定质量浓度后其巨噬细胞的分泌便不再增加，其机制可能为GH与巨噬细胞表面的GH受体结合而激活细胞内的某些转导通路，从而诱导其细胞因子的分泌，但当GH达到一定质量浓度后，由于与细胞表面受体结合饱和以及胞内相关信号途径均已激活而不再增加。

总之，作者利用人外周血分离和培养巨噬细胞，并发现GH具有与LPS相似的促进巨噬细胞细胞因子分泌的作用，说明GH可能参与免疫调节作用，然而GH如何调节巨噬细胞的这种功尚需要进一步研究。

［1］王辉.生长激素对免疫细胞功能调节的研究进展［J］.国外医学:内分泌学分册，2000，20(2):91

［2］ Savino W.Neuroendocrine control of Tcell development in mammals:role of growth hormone in modulating thymocyte migration［J］.Exp Physiol，2007，92(5):813

［3］王辉，邓洁英，史轶蘩.生长激素调节T淋巴细胞的功能［J］.中国免疫学杂志，2000，16(9):480

［4］杨志梅，符州，王莉佳，等.人外周血单核巨噬细胞诱导、培养及鉴定［J］.生物学杂志，2008，25(5):66

［5］ Wegrowski Y，Milard AL，Kotlarz G，et al.Cell surface proteoglycan expression during maturation of human monocytes-derived dendritic cells and macrophages［J］.Clin Exp Immunol，2006，144(3):485

［6］Lehtonen A，Ahlfors H，Veckman V，et al.Gene expression profiling during differentiation of human monocytes to macrophages or dendritic cells［J］.J Leukoc Biol，2007，82(3):710

［7］ Meazza C，Pagani S，Travaglino P，et al.Effect of growth hormone(GH)on the immune system［J］.Pediatr Endocrinol Rev，2004，1(Suppl 3):490

［8］Shimizu K，Adachi K，Teramoto A.Growth hormone enhances natural killer cell activity against glioma［J］.J Nihon Med Sch，2005，72(6):335

［9］ McCoy CE，O＇Neill LA.The role of toll-like receptors in macrophages［J］.Front Biosci，2008，13:62

［10］Roger T，David J，Glauser MP，et al.MIF regulates innate immune responses through modulation of Toll-like receptor 4［J］.Nature，2001，414(6866):920