液质联用技术检测硫酸多黏菌素B中各组分

刘孟娟，周陈西，胡方剑

(1.浙江省肿瘤医院药剂科，浙江 杭州 310022; 2.杭州中美华东制药有限公司，浙江 杭州 310022)

硫酸多黏菌素B为快速杀菌剂，美国传染病协会(IDSA)重点指出的“超级疯狂菌”铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，对其的耐药率不高[1]。其静脉滴注可治疗由多药耐药革兰阴性菌引起的严重感染，但因其有较严重的肾脏毒性和神经系统毒性而一度被弃用。近年来，多药耐药革兰阴性菌感染广泛流行，多黏菌素作为治疗的最后选择再次被应用于临床。硫酸多黏菌素B系由多黏芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素，由至少4种结构相近的成分组成，其中多黏菌素B1和B2是主要成分。第6版《欧洲药典》(EP 6.0)[2]建立了液相色谱法鉴定硫酸多黏菌素B各组分，经检索，国内尚无相关文献报道。笔者以高效液相色谱法以及液质联用技术检测硫酸多黏菌素B的各个组分，报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent);ZMD型质谱检测器;(Waters公司)Masslynx工作站。多黏菌素B(杭州中美华东制药有限公司，批号为100502);多黏菌素B对照品(欧洲药典标准品);甲醇、乙腈及其他试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

2.1.1 高效液相色谱条件(EP 6.0)

色谱柱:末端封尾 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱温:30℃;流动相:硫酸钠缓冲液(取4.46 g无水硫酸钠加入900 mL水中，用磷酸调节到pH=2.3，再用水定容到1 000 mL)－乙腈(80∶20);检测波长:215 nm;流速:1.0 mL/min;进样质量浓度:0.5 g/L;进样体积:20 μL。

2.1.2 液质联用色谱、质谱条件

色谱柱:Waters Symmetry C18柱(300 Å，150 mm ×2.1 mm，4 μm);流动相:乙腈－0.01 mol/L三氟乙酸溶液(80∶20);稀释液:乙腈－水(20∶80);柱温:30℃;质谱检测器中流速:0.25 mL/min;进样质量浓度:0.5 g/L;进样体积:20 μL。电喷雾电离源(ESI)，正离子检测，电离电压:310 kV;电喷雾接口干燥气(N2)流速:280 L/h，离子源温度:250℃;锥孔电压:30 V;脱溶剂气温度:115℃。

2.2 溶液制备

精密称取多黏菌素B对照品5 mg，置50 mL量瓶中，用水溶解并定容，摇匀，配成质量浓度为100 μg/mL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。精密称取样品5 mg，置50 mL量瓶中，用水溶解并定容，摇匀，配成质量浓度为100 μg/mL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 高效液相色谱法检测结果

多黏菌素B主要含有4个组分，分别为多黏菌素B1，B2，B3和B1－I。其主要成分为多黏菌素B1，保留时间为34 min;相对保留时间0.47的为多黏菌素B2，相对保留时间0.54的为多黏菌素，相对保留时间0.8的为B1－I。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.4 液质联用检测结果

高效液相色谱法的流动相中加入了大量非挥发性缓冲盐，而液质联用要求流动相不能含有此类盐，故不能直接采用同一流动相。参照文献[2]，采用无盐系统进行测定，建立了适用于多黏菌素B的液质联用方法。详见图2和图3。

图2 液质联用总离子流图

图3 液质联用各组分阳离子图

2.5 结果分析

多黏菌素B中4个主要组分的分子结构式为:

相对分子质量(M)等信息见表1。

表1 多黏菌素B主要组分信息

由于其为多肽类物质，因此在进入质谱检测器时带两个电荷，所以得到的阳离子检测结果约为相对分子质量的1/2。其中对照品主要成分的相对分子质量为602.6×2－2=1 204，样品主要成分的相对分子质量也一样，均与第6版《欧洲药典》给出的最大组分多黏菌素B1分子质量一致，故样品的主要成分为多黏菌素B1。由于多黏菌素B1－Ⅰ的相对分子质量也为1 204，其在高效液相色谱图中相对保留时间为0.80;检测得相对保留时间为0.47和0.54的两个物质相对分子质量同为1 190，参照第6版《欧洲药典》和文献[2]可知，多黏菌素B2比多黏菌素B3先出峰，故相对保留时间为0.47的物质为多黏菌素B2，相对保留时间为0.54的物质为多黏菌素B3。综上，样品各个组分分析结果见图4。

图4 样品各组分分析结果图

3 讨论

多组分抗生素中各组分含有相同的母核，仅是取代基有所不同，因此具有相同的质谱裂解规律。利用液质联用所测得的有关相对分子质量以及碎片峰的信息，结合色谱保留行为，可以快速、灵敏、准确地对组分结构进行鉴定，适用于多组分抗生素的组分分析[3]。因此，该项技术为硫酸多黏菌素B的质量控制提供了一种新方法。

[1]周颖杰，施耀国.多粘菌素B治疗耐多药病原菌研究进展[J].国际药学研究杂志，2008，35(4);292－294.

[2]Characterization of Polypeptide Antibiotics of the Polymyxin Series by Liquid Chromatograohy Electrospray Ionization Ion Trap Tandem Mass Spectrometry[J].Journal of Peptide Science，2002，7:45 － 55.

[3]胡 敏，胡昌勤.LC－MS分析乙酰吉他霉素组分及水解产物[J].药学学报，2006，41(5):476－480.