高效液相色谱法测定清开灵注射液中绿原酸含量

周海燕，李 丹

(北京中医药大学药厂，北京 101300)

清开灵注射液是临床必备中药注射剂之一，具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的功效，用于治疗热病神昏、中风偏瘫、神志不清等症。该品种由胆酸、猪去氧胆酸、水牛角粉、珍珠母粉、黄芩苷、金银花、栀子及板蓝根组成，被2005年版《中国药典(一部)》收载[1]。金银花与栀子药材中均含有绿原酸，为全面控制产品质量，笔者用高效液相色谱法测定清开灵注射液中绿原酸含量，并拟订了作为内控质量标准的含量限度。现报道如下。

1 仪器与试药

Spectra physics型高效液相色谱仪;SP－UV2000型检测器。绿原酸对照品(批号为110753－200413，中国药品生物制品检定所);清开灵注射液(批号分别为 912105A，912201A，912304A，912305A，912401A，912403A，913301A，913302A，913303A，913304A，北京中医药大学药厂)，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shimadzu －C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.4%磷酸溶液(13 ∶87);检测波长:327 nm;流速:1.0 mL/min。

2.2 溶液制备

精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含41.4 μg的溶液，即得对照品溶液(10℃以下保存)。取清开灵注射液，直接滤过，即得供试品溶液。取缺金银花、栀子的阴性样品溶液，直接滤过，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性考察:分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液，按上述色谱条件进样检测。结果对照品溶液、供试品溶液在相同保留时间处出现绿原酸的特征吸收峰，而阴性对照品溶液在相应位置上无干扰(图1)。

线性关系考察:分别精密量取对照品溶液各 2，5，10，15，20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值。以绿原酸对照品进样量(μg)对峰面积值进行回归处理，得回归方程 Y=2.0×106X－17 518，r=0.999 1(n=5)。结果表明，绿原酸进样量与峰面积的线性关系范围为 0.082 8 ～0.828 0 μg。

图1 高效液相色谱图

最低检测限确定:取对照品溶液，用50%甲醇稀释40倍，按上述色谱条件进样10 μL，测定信噪比(S/N)=3，则确定绿原酸的最低检测限为 0.01 μg。

精密度试验:取对照品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，连续6次，测定峰面积值。结果的 RSD为0.31%(n=6)。

重复性试验:取批号为912105A的清开灵注射液，直接滤过并进样10 μL，平行试验6份，测定绿原酸的含量。结果的 RSD为0.59%(n=6)。

稳定性试验:取批号为912105A的清开灵注射液，直接滤过，分别在 0，2，4，6，8 h 时进样 10 μL，测定峰面积值。结果的 RSD 为1.3%(n=5)。

加样回收试验:精密量取批号为913304A的清开灵注射液2.0mL，分别精密加入质量浓度为 47.6 μg/mL 的对照品溶液 0.5，1.0，1.5 mL，摇匀，直接滤过并进样 10 μL，每个浓度平行试验2份，测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 绿原酸加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取清开灵注射液10批，直接滤过，按上述色谱条件进样10 μL，测定绿原酸的含量。结果批号为 912105A，912201A，912304A，912305A，912401A，912403A，913301A，913302A，913303A，913304A的10批清开灵注射液中，绿原酸含量分别为0.028，0.011，0.039，0.038，0.014，0.018，0.036，0.034，0.024 g/L。

3 讨论

清开灵注射液处方中金银花与栀子均含有绿原酸，本试验用高效液相色谱法检测清开灵注射液中绿原酸含量，样品无须预处理，可直接滤过进样，不但简便、准确，而且在上述色谱条件下分离度好，可以快速检测制剂质量。

金银花含有挥发油、黄酮类、有机酸类、三萜皂苷类化合物，以及无机元素等，其中有机酸类化合物是主要有效成分[2]。绿原酸是金银花所含有机酸类成分中的一种，并不能完全代表金银花，也不是该药材专有，但目前仍作为控制金银花药材质量的指标之一。绿原酸遇热不稳定，因此在清开灵制备过程中，加热会破坏绿原酸，导致成品中绿原酸的转移率偏低。根据以上10批样品的含量测定结果，拟订本品每1 mL含绿原酸(C16H18O9)不得低于0.01 mg，此标准可作为清开灵注射液的内控质量标准。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:610－612.

[2]武晓红，田志勇，王 焕.金银花的研究新进展[J].时珍国医国药，2005，16(12):1 303 － 1 304.