职业苯接触工人外周血T－bet和GATA－3表达变化的特点*

曾可静， 李 萡△， 牛宇哲， 刘思初， 陈少华， 杨力建，左璨粲， 孙润陆， 梁赵佳， 陈嘉榆， 余 卫， 李扬秋

(1暨南大学医学院血液病研究所，广东广州510632;2广州市第十二人民医院，广东广州510620)

苯在工业上用途很广，慢性苯中毒是常见的一种职业病。现多项研究已表明苯对机体免疫系统造成损伤，机体免疫功能缺陷表现为对致病性微生物抵抗力下降导致感染性疾病;对机体异常细胞清除能力下降导致肿瘤的发生。免疫功能的下降也必然与免疫应答环节密切相关。有研究表明免疫应答调节的关键环节是Th1/Th2分化失衡，其与多种疾病的发生、发展和转归有关。而转录因子T-bet(T-box expressed in T cells)和GATA-3(GATA binding protein-3)分别作为Th1和Th2细胞特异性转录因子受到广泛关注[1]。T-bet和GATA-3分别特异性地表达于Th1细胞和Th2细胞，并最终影响Th0向Th1/Th2的分化。另外，T-bet与GATA-3均可形成自我激活的反馈调节环路，构成一个动态调节网络[2]。鉴于目前对接触苯后细胞免疫状态了解的不足，我们通过探究外周血中T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3 mRNA表达情况，以期为接触后致血液系统疾病研究提供新的资料。

材料和方法

1 研究对象

采集职业苯接触工人外周血标本25例，其中女性12名，男性13名，年龄20-62岁，平均(34.5±10.3)岁，工龄0.5-33岁，平均(10.5±9.8)年;慢性苯中毒工人外周血标本27例，其中女性16例，男性11例，年龄19-54岁，平均(35.1±10.9)岁，工龄1-35年，平均(8.2±8.0)年;健康体检者外周血标本20例，其中女性10例，男性10例，年龄20-57岁，平均(33.9±10.5)岁。苯接触和慢性苯中毒外周血标本均由广州市第十二人民医院提供。苯接触及慢性苯中毒工人均有职业接触苯史。接触苯、苯中毒工人和健康体检者均无影响造血和免疫功能的基础疾患、首次就诊3个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、无癌症史、放疗及化疗史、无其它骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。

2 方法

2.1 RNA提取和cDNA合成 按常规方法分离采集肝素抗凝外周血标本中单个核细胞。RNA提取应用Trizol试剂盒(Invitrogen)并应用随机引物和反转录酶试剂(Power ScriptTMReverse，BD)反转录合成cDNA第1链均按常规方法进行。

2.2 引物设计 GATA-3上游引物5'-TGGCACGGGACACTACCTG-3'，下游引物 5'-TCCCCATTGGCATTCCTC-3，扩增目的片段长度174 bp。T-bet上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下 游 引 物 5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，扩增目的片段长度119 bp。EEF内参上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下游引物5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，扩增目的片段长度100 bp。引物均由上海生工合成。

2.3 SYBR Green I实时定量PCR 在扩增效率一致性检测方法建立的基础上，每一标本分别进行T-bet和GATA-3以及EEF mRNA表达情况检测。总反应体积为25 μL，包括Real Master Mix 11.25 μL，0.4 mmol/L 上、下游引物1 μL等。95℃ 2 min变性，共进行45个循环扩增，每一循环包括95℃15 s，60℃ 1 min。GATA-3 mRNA在84℃读板，T-bet在82℃读板。记录1次荧光值，获得熔解曲线。反应在Chromo 4荧光定量PCR仪中进行。

2.4 PCR产物分析 对熔解曲线进行分析，同时进行20g/L琼脂糖凝胶电泳，以确定产物是否为所扩增的目的片段。

2.5 T-bet和GATA-3 mRNA相对定量分析 采用相对定量法分别分析接触苯、苯中毒工人与正常人相比较T-bet和GATA-3 mRNA差异表达。以EEF为内参照，利用实时定量PCR获得的T-bet和GATA-3 mRNA和EEF mRNA Ct值，采用相对定量法(2-ΔCt×100%，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因)计算苯接触、苯中毒工人与正常人T-bet和GATA-3 mRNA的相对表达量。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行One-way ANOVA统计分析。数据用均数±标准差(±s)表示。

结 果

1 T－bet和GATA－3表达产物的确定分析

通过琼脂糖凝胶电泳分析显示PCR产物片段大小正确。所有标本的EEF mRNA产物熔解曲线峰值均在81℃，正常人T-bet和GATA-3 mRNA产物熔解曲线峰值均分别在82℃和84℃。而个别接触苯、苯中毒工人T-bet和GATA-3 mRNA产物的熔解曲线则会出现多个不同宽度的峰。

2 苯接触及苯中毒工人外周血中T－bet和GATA－3表达情况

GATA-3在正常人的表达水平为0.39±0.22，与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例GATA-3表达水平呈上升趋势(0.57±0.54)，慢性苯中毒工人组中则有20例GATA-3表达水平呈上升趋势(0.52±0.50)。此外，在职业接触苯工人组中发现6例GATA-3表达水平显著下降(0.15±0.12，P＜0.05)，同样在慢性苯中毒工人组中也有7例GA-TA-3表达水平显著下降(0.07±0.06，P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of GATA-3 mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BEGI:benzene-exposed group with increased expression of GATA-3(n=19);BPGI:benzene poisoning group with increased expression of GATA-3(n=20);BEGD:benzene-exposed group with decreased expression of GATA-3(n=6);BPGD:benzene poisoning group with decreased expression of GATA-3(n=7).*P＜0.05 vs normal.图1 职业接触苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中GATA－3 mRNA的表达

T-bet在正常人的表达水平为2.15±1.45，与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例T-bet表达水平呈下降趋势(1.91±1.49)，在慢性苯中毒工人组27例T-bet表达水平呈下降趋势(1.52±0.56)。此外，在职业接触苯工人组中也可发现6例T-bet表达水平显著上升(3.19±2.10，P ＜0.05)，见图2。

综合分析2组样本中2个基因表达变化特点发现，大部分职业接触苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3和T-bet表达模式是GATA-3表达水平上升伴T-bet表达水平下降趋势。但28%的职业接触苯工人的GATA-3表达下降伴T-bet表达水平上升相反的趋势;约22%的慢性苯中毒工人GATA-3表达水平显著下降。这种双向表达变化特点在GATA-3中可同时见于苯接触和苯中毒组样本，而在T-bet则仅见于苯接触组。大部分苯接触和苯中毒工人中T-bet/GATA-3比值分别为4.17±2.17和4.01±2.03，与对照组(6.15±3.73)相比有下降的趋势。而在6例接触苯工人T-bet/GATA-3比值(42.7±40.1)呈相反趋势变化，与对照组相比明显上升(P＜0.05);同样7例苯中毒工人的上述2个基因表达水平均下降的T-bet/GATA-3为24.95±14.10，与对照组相比也明显上升(P＜0.05)。

Figure 2.The expression of T-bet mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BETD:benzene-exposed group with decreased expression of T-bet(n=19);BPTD:benzene poisoning group with decreased expression of T-bet;BETI:benzene-exposed group with increased expression of T-bet(n=6)*P＜0.05 vs normal.图2 职业接触苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中T－bet mRNA的表达

讨 论

苯是目前应用最为广泛的化工原料和工业溶剂之一。队列研究证明职业接触苯人群发生血液淋巴系统恶性疾病的相对危险性明显增加。吸入苯后的毒性主要与其代谢产物密切相关，有关慢性苯中毒以及苯致再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和白血病确切发病机制仍不明确。普遍认为是多因素、多水平综合作用的结果。我们的前期研究发现了苯接触对于T细胞谱系的分布，T细胞克隆性增殖和胸腺近期输出功能以及T细胞活化过程都有影响[3-5]。由于T细胞调节的变化同样影响机体的正常T细胞免疫功能，其调节异常与自身免疫性疾病的发生和肿瘤的发生发展密切相关。本研究进一步分析苯接触是否对机体Th1和Th2型细胞的平衡产生影响。

T-bet和GATA-3基因所编码的转录因子分别作为Th1和Th2细胞特异性转录因子，T-bet和GATA-3失衡与一些疾病，包括自身免疫性疾病的发生及进展有着密切联系[6]。因此，本研究通过对这2个基因的表达变化分析初步了解苯接触和苯中毒对Th1和Th2型细胞的平衡的影响情况。研究结果显示:大部分职业接触苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3表达水平上升伴T-bet表达水平下降趋势。GATA-3表达上升其原因可能与苯代谢产物影响Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-6 生成增加相关[7]。另一方面，苯接触或苯中毒后，由于T细胞异常活化，NF-κB的表达变化也可能参与了GATA-3调节表达。在NF-κB缺陷小鼠中，CD4+T细胞不能表达Th2细胞中的GATA-3，但可表达Th1细胞的T-bet和 IFN- γ[8，9]。此外也有研究表明 GATA-3 的表达上调是通过激活Ras/MAPK及calcineurin钙依赖磷酸酶途径所致，这两个途径的激活又依赖于转录因子c-Myb。

而GATA-3和T-bet是两个相互调节、相互抑制的转录因子。T-bet基因表达下降的负调控途径:(1)GATA-3及STAT-6可抑制T-bet的产生;(2)Th2细胞转录因子Jun B对T-bet也存在抑制作用;(3)此外在研究氧化还原失衡对免疫衰老作用的分子机制时发现，过氧化物酶体增殖激活受体 α(peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα)通过抑制p38丝裂酶原激酶活性抑制T-bet的转录[10]。而有研究证明苯的代谢产物确实可以改变细胞的氧化还原状态[11]。

大部分苯接触及苯中毒工人中外周血T-bet/GATA-3比值均低于健康对照，表现为GATA-3高表达伴T-bet表达下降趋势，这一变化也可以反映其Th1和Th2的变化情况，该变化特点与在肿瘤患者中所发现的Th1和Th2型细胞因子的表达状况相吻合[12]。肿瘤病人Th2细胞阳性率升高，Th1细胞阳性率降低，Th1/Th2阳性细胞比值降低，同时Th1型细胞因子降低，Th2型细胞因子升高，表现为Th2优势的漂移状态。这其中的相关性有待进一步的分析。

另一方面，小部分病人出现了完全相反的GATA-3/T-bet表达模式，提示机体中Th1/Th2的变化与大多数病人完全不同，这种不同的模式，与有关研究中所发现的再障病人中 T-bet和 GAT-3表达异常变化相同[13，14]，是否提示这部分病人与再障的发生存在一定的关联性，有待进一步对病人的资料进行跟踪分析。

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