p38 MAPK信号通路在雨蛙素诱导的胰腺AR42J细胞炎症反应中的作用

陆邦超，邹大进

(第二军医大学南京临床医学院，南京军区南京总医院内分泌科，江苏 南京 210002)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床常见的危重疾病，起病急骤，病情发展迅速，病死率较高，特别是重症急性胰腺炎(SAP)机制复杂、治疗困难，病死率高达30% －50%[1，2]。目前认为AP的发病包含有复杂的级联反应，始于胰腺腺泡细胞内的炎症反应[3]。疾病早期阶段胰腺腺泡细胞产生的前炎症细胞因子和化学趋化因子，不仅造成了胰腺细胞自身损伤，同时募集了体内大量炎症细胞向胰腺的浸润，进而导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)以及多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。因此对胰腺腺泡细胞早期事件的了解，有助于阐明AP的发病机制。p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一。p38 MAPK通路的激活可促进TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8等多种促炎因子的表达和释放，被认为是调控炎症反应的中心环节[4]，与急性胰腺炎，尤其是急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)的发生、发展密切相关。且研究发现p38 MAPK信号转导通路与核转录因子κB(nuclear factor kappaB，NF－κB)信号途径可能存在着交汇作用，相互影响[5，6]。目前国内外学者多采用制造各种体内动物模型对急性胰腺炎进行研究，急性胰腺炎的体外研究较少见。本研究采用雨蛙素刺激AR42J细胞构建急性胰腺炎的体外模型，探讨p38 MAPK信号分子在其炎症细胞因子表达方面的作用及其可能机制，以期为急性胰腺炎发病的分子机制提供一定的理论依据。

材料和方法

1 材料

大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞株(购自中国典型培养物保藏中心，No.GDC147);含有血清的完全培养基(RPMI－1640)和 p38 MAPK 抑制剂 SB203580[7]购自 Sigma;血清淀粉酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;p－p38 MAPK、TNF－α和NF－κB检测试剂盒购自碧云天公司。

2 方法

2.1 细胞培养和实验分组 大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞株用含有血清的RPMI－1640置于37℃温箱中培养，当细胞生长到2.5×109cells/L时进行传代。将细胞接种于6孔板中，饥饿培养使细胞同步化，分为3组:(1)正常对照组:细胞常规培养;(2)雨蛙素组:培养皿内加入等量DMSO，30 min后加入10－8mol/L雨蛙素进行培养;(3)p38 MAPK抑制剂SB203580 组:培养皿内加入 SB20358010 μmol/L，30 min 后加入10－8mol/L雨蛙素进行培养。3 h后取标本检测相关指标，每组设3个样本，实验重复3次。

2.2 悬浮细胞免疫荧光染色 取100 μL细胞悬液滴至1.5 mL EP管中，每管中加入甲醛溶液200 μL，室温静置20 min。3000×g离心3 min，吸出固定液，加入1 mL双蒸水，放置5 min，然后3000×g离心5 min，吸出双蒸水后加入200 μL TPBS，室温放置20 min，PBS 洗3 遍。加入Ⅰ抗，37 ℃孵育1 h后，用PBS洗3遍，加入Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤3遍，加DAPI使终浓度为20 mg/L染色3 min。将处理好的细胞悬液滴在载玻片上，甘油封片后立即进行激光共聚焦显微镜观察。

2.3 细胞淀粉酶分泌率 采用酶动力学方法，分别测定腺泡细胞和细胞培养上清中的淀粉酶，淀粉酶分泌率=(细胞上清淀粉酶/细胞总淀粉酶)×100%。

2.4 Western blotting测定腺泡细胞p－p38 MAPK和TNF－α表达 按照操作说明用细胞裂解液抽提胞浆蛋白，以Bardford法测定胞浆总蛋白;按20 μg蛋白样本/孔进行 SDSPAGE电泳，结束后电转移至PVDF膜;以50 g/L脱脂奶粉的1×TBST溶液室温封闭PVDF膜;p－p38 MAPK和TNF－αⅠ抗温育，洗膜;IgG－HRPⅡ抗温育，洗膜，加ECL发光剂对胶片曝光;使用凝胶成像分析系统对目的条带进行扫描和密度分析，以相应蛋白条带的平均吸光度值来表示p－p38 MAPK和TNF－α水平的相对强度。

2.5 凝胶电泳迁移率(electrophoretic mobility assay，EMSA)测定腺泡细胞NF－κB活性 (1)按低盐溶解继以高盐提取法提取核蛋白。(2)采用Bardford法测定胞浆总蛋白。(3)标记NF－κB寡核苷酸探针:5 pmol/L NF－κB寡核苷酸探针(5'－AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC－3')在10U T4多核苷酸激酶作用下，加入5 U γ－[32P]ATP，于37℃反应10 min，加入1 μL的0.5 mol/L EDTA终止反应。(4)采用4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。(5)DNA结合反应:核蛋白(30 μg)与2 μL结合缓冲液在9 μL总反应体积中室温下反应10 min，加入[32P]标记的NF－κB寡核苷酸探针1 μL后室温下继续反应20 min。加入1 μL的上样缓冲液终止反应。(6)DNA蛋白复合物电泳:将4%非变性聚丙烯酰胺在0.5×TBE，380 V电压下预电泳10 min，加样后继续电泳至溴酚蓝移至胶全长3/4处。将胶真空干燥后，暗室内放入X光片盒内，－70℃曝光24－48 h。用Imagel图像分析灰度值。

3 统计学处理

应用SPSS 12.0统计学软件处理数据，数据以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析。

结 果

1 胰腺腺泡细胞P38活化后的核移位

正常AR42J细胞饱满，边界清楚，折光性强。细胞呈簇状聚集成团，不贴壁。细胞质中有P38激酶蛋白荧光弱荧光表达，细胞核呈“核空染”状态。当细胞受到雨蛙素刺激后，细胞明显收缩变形，主要是细胞膜收缩变皱。p38蛋白荧光变强，区域几乎分布于整个细胞，细胞核中亦有明显显现。提示p38由胞浆向胞核移位。SB203580组细胞分布较散在，p38蛋白荧光区域几乎分布于细胞质，细胞核中未见有明显显现，见图1。

Figure1.The translocation of p－p38 MAPK to nuclei was imaged by immunofluorescence(×200).A:normal group;B:cerulein group;C:SB203580 group.图1 免疫荧光染色观察p－p38 MAPK核移位

2 胰腺腺泡细胞淀粉酶分泌率

雨蛙素组胰腺腺泡细胞淀粉酶分泌率显著高于对照组(P＜0.01);SB203580组淀粉酶分泌率均较雨蛙素组显著降低(P ＜0.01)，见表1。

表1 各组AR42J细胞淀粉酶分泌率Table1.Secretion rates of amylase in AR42J cells(%..n=9)

表1 各组AR42J细胞淀粉酶分泌率Table1.Secretion rates of amylase in AR42J cells(%..n=9)

＊＊P ＜0.01 vs normal;##P ＜0.01 vs cerulein group.

Group Secretion rate of amylase Normal 13.18 ±0.39 Cerulein 40.41 ±1.16＊＊SB203580 29.88 ±1.26＊＊##

3 胰腺腺泡细胞p－p38 MAPK和TNF－α表达

Western blotting结果显示总p38 MAPK蛋白各组无差别。正常对照组中p－p38 MAPK(0.22±0.12)和TNF－α(0.59±0.12)蛋白表达量较低。与正常对照组相比，雨蛙素组p－p38 MAPK蛋白(0.52±0.19)、TNF－α蛋白(1.62±0.27)表达量明显增高(均P＜0.01)。而与雨蛙素组相比，SB203580组p－p38 MAPK(0.39±0.10)和TNF－α(1.08±0.10)均降低(P ＜0.05，P＜0.01)，见图2、3。

Figure2.p－p38 MAPK protein expression in AR42J cells detected by Western blotting.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.图2 Western blotting检测AR42J细胞p－p38 MAPK蛋白表达

Figure3.TNF－α protein expression in AR42J cells detected by Western blotting.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.图3 Western blotting检测AR42J细胞TNF－α蛋白表达

4 胰腺腺泡细胞NF－κB的活性

正常对照组中NF－κB活性较低(87.32±10.71)。雨蛙素组(138.83±7.87)较正常对照组NF－κB活性明显增高(P＜0.01)。SB203580组(111.26±9.39)较雨蛙素组降低(P ＜0.01)，见图4。

讨 论

AR42J细胞为大鼠胰腺腺泡细胞株，具有同正常胰腺腺泡细胞一样的受体表达和信号转导。所以，该细胞株被广泛地应用于离体实验中，用来研究内分泌胰腺细胞的分泌、信号转导、细胞骨架功能、凋亡和胰腺的炎症反应。众所周知，过量的雨蛙素刺激AR42J细胞可以快速诱导产生急性胰腺炎，具有高度的可重复性。这个促分泌剂诱导的细胞模型是观察胰腺病理生理事件良好的体外模型[8]。

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已证实[9，10]，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的四大信号系统之一，其参与了细胞生长、发育及细胞间功能同步等多种生理过程。其中p38 MAPK信号通路与炎症反应调控机制密切相关，其静息状态下主要分布于细胞浆，激活后转移至细胞核内，通过磷酸化转录因子来调节细胞因子等各种效应基因的表达。大量研究表明[5，11，12]，p38MAPK在AP大量活化，促进炎性细胞因子和趋化因子TNF－α、1L－lβ、IL－8等的表达，使炎症反应调控失衡，导致级联“瀑布”效应。p38 MAPK信号通路不但与胰腺本身的病程发展相关，而且可能参与急性肺损伤的发生[13，14]。应用p38 MAPK阻滞剂能明显抑制炎症因子的释放，改善胰腺及肺组织的病理损伤[15]，减轻胰腺炎的病情，提高术后生存率[16]。

Figure4.NF－κB activation in AR42J cells detected by electrophoretic mobility assay.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.图4 EMSA检测AR42J细胞NF－κB活性

本实验予雨蛙素刺激胰腺 AR42J细胞后，发现 p38 MAPK被激活，其蛋白磷酸化水平增高，p－p38 MAPK由细胞浆向细胞核转位，诱导了炎症细胞因子TNF－α的生成，加重了细胞的损伤(淀粉酶分泌增高)。该结果与 Blinman等[5]实验结果一致。采用p38 MAPK抑制剂SB203580后，能明显降低胰腺细胞TNF－α和淀粉酶的生成，减轻胰腺细胞损伤。而且实验发现SB203580可以使AR42J细胞NF－κB的转录水平下降，抑制其NF－κB的活性。这提示p38 MAPK信号通路还参与了雨蛙素诱导的急性胰腺炎胰腺细胞的NF－κB的活化。

本实验结果表明p38 MAPK信号通路在急性胰腺炎胰腺细胞中即被激活，上调促炎细胞因子的表达，在胰腺局部损伤中发挥重要作用。p38 MAPK信号通路还参与了胰腺细胞NF－κB的活化，而不断产生的炎性因子使炎症反应调控失衡，导致级联“瀑布”效应，使局部炎症向全身发展提供了契机。因此，p38 MAPK信号的活化可能是急性胰腺炎胰腺损伤的重要发病机制，而p38 MAPK抑制剂显示出的抗炎效应无疑为治疗急性胰腺炎提供了一条新的思路。

[1]Frossard JL，Steer ML ，Pastor CM.Acute pancreatitis[J].Lancet，2008，371(607):143 －152.

[2]Cappell MS.Acute pancreatitis:etiology，clinical presentation，diagnosis，and therapy[J].Med Clin North Am，2008，92(4):889 －923.

[3]Ju KD，Yu JH，Kim H，et al.Role of mitogen－activated protein kinases，NF－κB，and AP－1 on cerulein－induced IL － 8 expression in pancreatic acinar cells[J].Ann N Y Acad Sci，2006，1090:368 – 374.

[4]Schindler JF，Monahan JB，Smith WG.p38 pathway kinases as anti－ inflammatory drug targets[J].J Dent Res，2007 ，86(9):800－811.

[5]Blinman TA，Gukovsky I，Mouria M.Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue:cytokine upregulation via p38 MAP kinase[J].Am J Physiol Cell Physiol，2000，279(6):C1993 － C2003.

[6]Twait E，Williard DE，Samuel I.Dominant Negative p38 mitogen－activated protein kinase expression inhibits NF－ κB activation in AR42J cells[J].Pancreatology，2010，10(2－3):119－128.

[7]Scior T，Domeyer DM，Cuanalo － Contreras K，et al.Pharmacophore design of p38α MAP kinase inhibitors with either 2，4，5 － trisubstituted or 1，2，4，5 － tetrasubstituted imidazole scaffold[J].Curr Med Chem，2011，18(10):1526－1539.

[8]Chen P，Huang L，Zhang Y，et al.SiRNA － mediated PIAS1 silencing promotes inflammatory response and leads to injury of cerulein－stimulated pancreatic acinar cells via regulation of the p38 MAPK signaling pathway[J].Int J Mol Med，2010，26(4):619 －626.

[9]Kim EK，Choi EJ.Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases[J].Biochim Biophys Acta，2010，1802(4):396 －405.

[10]Kam B.MAPK signaling pathways as molecular targets for anti－inflammatory therapy－from molecular mechanisms to therapeutic benefits[J].Biochim Biophys Acta，2005，1754(1－2):253－262.

[11]Samuel I，Zaheer A，Fisher RA.In vitro evidence for role of ERK，p38，and JNK in exocrine pancreatic cytokine production[J].J Gastrointest Surg，2006，10(10):1376－1383.

[12]Chen P，Zhang Y，Qiao M，et al.Actiated protein C，an anticoagulant polypeptide，ameliorates severe acute pancreatitis via regulation of mitogen－activated protein kinases[J].J Gastroenterol，2007，42(11):887 － 896.

[13]Ren HB，Li ZS，Xu GM，et al.Dynamic changes of mitogen－activated protein kinase signal transduction in rats with severe acute pancreatitis[J].Chin J Dig Dis，2004，5(3):123－125.

[14]詹丽英，李文澜，柯 伟，等.内毒素急性肺损伤中p38 MAPK、NF－κB与 HO －1的关系[J].中国病理生理杂志，2010，26(9):1790 －1795.

[15]任洪波，李延青，程宝泉，等.丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路抑制剂对重症急性胰腺炎治疗作用的实验研究[J].中华消化杂志，2006，26(5):343 －345.

[16]Pereda J，Sabater L，Cassinello N，et a1.Effect of simultaneous inhibition of TNF－α production and xanthine oxidase in experimental acute pancreatitis:the role of mitogen activated protein kinases[J].Ann Surg，2004，240(1):108－116.