FAK shRNA抑制白血病BCR/ABL－BaF3细胞生长*

许吕宏， 方建培， 翁文骏， 潘 莉

(中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120)

化学药物治疗是白血病治疗的主要手段之一，成人白血病化疗后5年生存率约40%，儿童白血病化疗后5年生存率约80%［1］。BCR/ABL基因是人体细胞第9号染色体ABL原癌基因与第22号染色体BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起蛋白激酶持续性活化，是白血病不良预后因素之一［2］。临床发现有部分患者对该化疗药物不敏感，出现耐药现象，应用分子靶向治疗是解决该问题的新策略。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一种细胞内非受体型酪氨酸激酶。FAK基因定位于人染色体8q24，编码1 052个氨基酸，其蛋白质分子量为125 kD。研究发现，FAK在正常细胞的生长周期、增殖分化、迁移运动及血管生成等过程均发挥重要作用;并且，FAK在多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞激活过程及侵袭转移中也起关键作用，渐成为目前肿瘤治疗的新靶点［3，4］。本实验拟应用 BCR/ABL－BaF3白血病细胞株为研究对象，构建FAK shRNA慢病毒载体，通过体外及动物体内实验研究FAK基因沉默对白血病细胞生长的影响。

材料和方法

1 材料及动物

BCR/ABL－BaF3白血病细胞株由美国哈佛大学波士顿儿童医院Le Yi博士惠赠。RPMI－1640培养基及胎牛血清购自Invitrogen，抗FAK单克隆抗体购自 Upstate，抗 β－actin、STAT5、p－STAT5、caspase－3、caspase－9单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology，甲基纤维素半固体培养基MethoCult® M3630购自Stem Cells。无特定病原体(SPF级)BALB/c小鼠，雄性，6－8周，体重18－20 g，由中山大学北校区实验动物中心提供并饲养。

2 FAK shRNA转染

按照文献［5］方法，应用含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的慢病毒载体，插入FAK shRNA序列，经筛选得到最有效的FAK shRNA序列是5’－GGAATGCTTCAAGTGTGCT－3’。体外应用RPMI－1640完全培养基培养BCR/ABL－BaF3白血病细胞株，分别将FAK shRNA或空白对照的慢病毒转染至该细胞株中，流式细胞仪分选转染后GFP阳性细胞用于实验研究。

3 Western blotting检测

流式分离转染后GFP阳性的BCR/ABL－BaF3细胞，应用细胞裂解液提取细胞总蛋白。分别取蛋白100 μg上样，经10%SDS－PAGE凝胶电泳后转至二氟化树脂(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，PVDF膜用5% 脱脂奶室温封闭2 h。分别加入1∶200 I抗(抗 FAK、β－actin、STAT5、p－STAT5、caspase－3、caspase－9等单克隆抗体)，4 ℃轻摇过夜。TBS洗膜3次后加1∶5 000 II抗(山羊抗小鼠IgG)，室温平衡1 h。TBS洗膜3次后ECL显色。应用专门的图像分析软件计算显影的强度。

4 白血病细胞生长及集落培养

4.1 体外细胞增殖生长 流式细胞仪分选GFP阳性白血病细胞于体外培养，取2×105白血病细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI－1640完全培养基中，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养3 d，每天计算细胞数量的增殖情况。

4.2 细胞集落培养 取5×102白血病细胞重悬于100 μL PBS缓冲液，然后置于1 mL甲基纤维素半固体培养体系进行集落培养，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养7 d，计数白血病细胞集落，以细胞数大于40个为一个集落。

5 FAK shRNA抑制白血病生成

5.1 白血病动物模型的建立 调整转染后BCR/ABL－BaF3白血病细胞浓度至5 ×1010/L，取1×106(0.2 mL)白血病细胞经尾静脉输注到BALB/c小鼠体内。取含FAK shRNA白血病细胞组为实验组，不含FAK shRNA白血病细胞为对照组，每组小鼠15只。

5.2 白血病生成检测 每天观察小鼠的生存情况，记录死亡时间，绘制生存曲线。白血病细胞输注后第25 d，分别处死5个小鼠(实验组和对照组)，分离小鼠脾脏，比较脾脏肿大情况，流式细胞仪检测脾脏中GFP阳性细胞表达率。

6 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，应用t检验或单因素方差分析;绘制Kaplan－Meier生存曲线并进行log－rank检验，检验水准设α=0.05。

结 果

1 Western blotting检测蛋白表达水平

含FAK shRNA慢病毒载体转染至白血病细胞为FAK基因沉默组，不含FAK shRNA的慢病毒载体转染白血病细胞为空白载体对照组，分别应用流式细胞仪检测GFP阳性百分比，结果示2组的转染率为21%－32%，差异无显著(P＞0.05)。如图1所示，与空白载体对照组相比，FAK shRNA能明显抑制细胞FAK蛋白水平的表达，见图1A。FAK shRNA对细胞内STAT5蛋白表达无显著影响，而明显降低STAT5蛋白磷酸化水平，见图1B。FAK shRNA可引起细胞内caspases－3活化，见图1C，而对caspases－9的活化无显著影响，见图1D。

Figure 1.Western blotting analysis protein expression and caspases activity.A:FAK expression;B:STAT5 phosphorylation;C:caspase－3activation;D:caspase－9 activation.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs vector group.图1 Western blotting检测蛋白表达水平及caspase活性

2 体外实验中FAK shRNA抑制细胞生长

分别取2×105空白载体对照组及FAK shRNA组的白血病细胞体外培养3 d，每天计算细胞数量的增殖情况。如图2所示，第24 h，空白载体对照组与FAK shRNA组细胞计数分别为(2.60±0.26)×105和(2.16±0.28)×105，2组差异无显著(P＞0.05);第48 h，空白载体对照组与FAK shRNA组细胞计数分别为(4.50±0.50)×105和(3.43±0.32)×105，2组差异显著(P＜0.05);体外培养第72 h，2组细胞计算分别为(8.13±0.61)×105和(5.20±0.53)×105，2组差异显著(P＜0.01)，提示 FAK shRNA能抑制细胞生长。另外，取5×102白血病细胞于甲基纤维素半固体培养体系中培养7 d，集落计数结果发现，空白载体对照组与FAK shRNA组中集落数量分别为215.60±13.01和125.00±9.06，2组差异显著(P＜0.01)，提示FAK shRNA抑制细胞集落形成。

Figure 2.Cell growth and colony formation in vitro.A:cells growth in RPMI－1640 medium for 72 h;B:colony formation in methylcellulose medium for 7 d.±s.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs vector group.图2 体外实验中细胞生长及集落形成情况

3 动物体内实验示FAK shRNA抑制白血病细胞生长

取1×106BCR/ABL－BaF3白血病细胞经尾静脉输注到BALB/c小鼠体内建立白血病动物模型。生存分析显示，空白载体对照组的小鼠于白血病细胞输注的第21－27 d全部死亡，生存中位数是24 d;而FAK shRNA组小鼠于白血病细胞输注的第52－60 d全部死亡，生存中位数是55 d，2组差异显著(P＜0.05)，见图3A。白血病细胞输注后第25 d分离小鼠脾脏，发现白血病小鼠脾脏比正常小鼠脾脏明显肿大;与空白载体对照相比，FAK shRNA能明显减轻脾脏肿大，见图3B。空白载体对照组与FAK shRNA组小鼠脾脏中GFP阳性细胞百分比分别为(82.40±6.13)%和(14.50±3.70)%，2组差异显著(P＜0.01)。结果表明FAK shRNA能抑制白血病细胞生长。

讨 论

Figure 3.FAK shRNA inhibits the growth of BCR/ABL－BaF3 cells in vivo.A:survival curves of mice after injection of BCR/ABL－BaF3 cells;B:leukemic mice developed splenomegaly on day 25，but FAK silencing reduced the size of spleen compared with the vector.The volume of spleen in normal group，vector group and FAK shRNA group was(0.22±0.07)cm3，(1.60±0.25)cm3and(0.51±0.12)cm3，respectively.n=3.图3 动物体内实验示FAK shRNA抑制白血病细胞生长

BaF3细胞是一种来源于小鼠前B淋巴细胞的白血病细胞株，体外培养依赖细胞因子IL－3;而转染BCR/ABL基因的BaF3细胞的生长不需细胞因子IL－3［6］。本实验应用BCR/ABL－BaF3细胞株作为研究对象，应用RNA干扰技术将FAK基因沉默，研究FAK shRNA对白血病生长的影响。体外实验结果表明FAK shRNA能抑制白血病细胞生长及集落形成。本实验将BCR/ABL－BaF3白血病细胞经尾静脉注射到BALB/c小鼠体内，成功建立白血病动物模型。动物体内实验证实FAK shRNA能抑制白血病生成，延长白血病动物模型的生存时间。我们实验结果说明FAK shRNA能明显抑制白血病细胞生长。

FAK在正常细胞或肿瘤细胞的生命活动中发挥重要作用。临床研究发现，FAK与白血病的进展及预后有关。国外有研究分析60例急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的血液标本，发现42%白血病细胞高表达 FAK蛋白及 mRNA，46%CD34+白血病细胞表达FAK蛋白［7］。最近有研究也分析36例AML病例，发现患者肿瘤细胞中FAK蛋白高表达则其预后相对较差，说明FAK是影响白血病患者生存率的重要因素之一［8］。Shahzad 等［9］研究发现，FAK shRNA能增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，并通过caspase－3蛋白酶诱导细胞凋亡。最近国内也有学者关注FAK基因在白血病细胞的表达及意义。有学者应用酪氨酸激酶抑制剂处理K562白血病细胞株，发现随着化疗药物浓度增加，K562细胞内FAK mRNA表达逐渐降低，提示该化疗药物可能通过降低FAK mRNA表达而抑制白血病细胞增殖［10］。研究结果提示FAK基因可作为白血病治疗的新靶点。

FAK在细胞生长中扮演重要角色，有研究表明FAK介导细胞生存的信号转导通路主要有:(1)PI－3K－PKB－Bad－GSK3。FAK结构中Tyr397位点的磷酸化可激活PI－3K激酶，进而活化第二信使PI(3，4，5)P3 和 PI(3，4)P2，最终活化磷脂蛋白酶PKB。PKB活化后通过灭活一系列细胞凋亡蛋白如Bad、GSK3 等而提供细胞生存信号［11］。(2)Src－p130CAS－Ras－JNK。细胞外基质与FAK介导的生存信号可通过Src使p130CAS磷酸化，激活Ras信号及JNK［12］。(3)阻断肿瘤抑制因子p53信号。研究发现FAK的N端能与p53分子N端相结合，两者相互作用能降低p53分子的转录活性，阻断凋亡蛋白的信号，促使细胞获得生存信号［13］。有关 FAK shRNA治疗白血病的作用机制尚未明确，我们既往研究发现FAK shRNA能诱导白血病细胞凋亡［5］。本实验进一步发现FAK shRNA能明显降低STAT5蛋白磷酸化水平，并引起caspases－3的活化，提示FAK shRNA作用途径可能与STAT5及caspases－3有关。BCR/ABL基因是人体细胞第9号染色体ABL原癌基因与第22号染色体BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起FAK蛋白激酶持续性活化［14］。本实验结果提示通过FAK基因沉默能抑制BCR/ABL基因的成瘤性，具体分子信号通路仍有待深入探讨。

综上所述，FAK shRNA能抑制FAK蛋白表达，体外实验发现FAK shRNA抑制白血病细胞生长，动物体内实验也证实FAK shRNA能抑制白血病生成，为FAK基因沉默治疗白血病提供实验基础。

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