六神丸及其组分雄黄、蟾酥与无机砷急性毒性比较

梁世霞， 余丽梅， 苗加伟， 吴 芹， 刘 杰*

(1．遵义医学院药理学教研室/贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义563003;2．遵义医学院 细胞工程重点实验室，贵州遵义563003)

六神丸是中国传统中药的四大名药之一，在中国的药用史长达300多年，组方中含有蟾酥、雄黄等6味名贵中药材;对咽喉肿痛、口舌糜烂、牙痛、流行性腮腺炎等的治疗有独到的功效［1］，近年来也被用于治疗流行性感冒、带状疱疹、寻常疣和肿瘤等多种疾病［2］。其组方中的雄黄和蟾酥都是有毒中药材，大量或长期摄入会引起中毒［3-4］。六神丸引起的不良反应报道也有不少，不合理用药可引起患者死亡，尤其是新生儿及婴幼儿死亡事件时有发生。六神丸究竟有多毒?六神丸含雄黄，其毒性是否等同于一般的无机砷化物?六神丸的毒性是蟾酥还是雄黄引起的?本实验将六神丸、雄黄和蟾酥的急性毒性与无机砷进行比较，为六神丸的临床合理应用提供科学依据。

1 材料

1．1 材料 六神丸、雄黄(＞90%As4S4)和蟾酥均购自苏州雷允上有限公司;砷酸氢二钠，美国Sigma公司;PCR纯化试剂盒，上海华舜生物技术有限公司批号2006A;逆转试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司批号DRR037A;Trizol宝生物工程(大连)有限公司 批号D91084;SYBR Green荧光染料(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA);硝酸(优级纯)批号T20090902国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均分析纯等级。

1．2 动物 昆明种成年小鼠购自重庆市实验动物质检中心，清洁级，18～22 g，雌雄各半，合格证:NO．0002438，饲养于(22±1)℃，(50±2)%的相对湿度，日昼12 h交替的动物室。

1．3 主要仪器 TU-180紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;多功能梯度PCR仪，型号:22331;冷冻离心机，型号:5417R;冷冻离心机，型号:X-15R;实时荧光定量PCR仪，美国，型号:Icyclery IQ;Leica QwinV3图像分析系统，德国Leica公司;消化用电热鼓风恒温干燥箱，型号:101B-2上海电热仪器总厂;双道原子荧光光度计，北京科创海光仪器有限公司，型号:NO．L1d049。

2 方法

2．1 分组及给药 昆明种小鼠适应性饲养1周后随机分为5组，每组6只，分别为正常对照组、六神丸组(200 mg/kg，含雄黄或蟾酥 26．6 mg/kg，40 倍的临床日用药量)、雄黄组(30 mg/kg，相当于As 21 mg/kg)、蟾酥组(30 mg/kg)、Na2HAsO4·7H2O 组(As5+，44 mg/kg，相当于 As10．5 mg/kg)，分别灌胃给予(0．2 mL/10 g)以上各药物，正常对照组给予等体积的生理盐水。给药后观察小鼠的一般状况，8 h后断颈处死小鼠取材。

2．2 血清ALT、AST、BUN测定 收集血液离心取血清，自动分析仪定量检测血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，评估肝、肾功能。

2．3 组织中砷含有量检测 取肝、肾和心组织，称质量100 ～200 mg，加入5 mL 浓硝酸，170 ℃、2．5 h高温消化，去离子水定容到25 mL，混匀后取5 mL加入1 mL 5%的硫脲-抗坏血酸混合液，混匀后静置30 min，原子荧光法检测组织内砷蓄积量。

2．4 病理学观察 取同部位肝、肾和心组织，用甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，双盲法在普通光学显微镜下观察病理学改变，取典型照片进行病理学分析。

2．5 MT-2 mRNA检测 取肝、肾和心组织50～100 mg，加入细胞裂解液Trizol 1 mL，按照说明书提取、纯化总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，凝胶电泳检测其完整性，用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒逆转录酶和寡脱氧胸苷酸逆转MT-2 mRNA，其上游引物序列为TGTGCCTCCGATGGATCCT，下游引物序列 GCAGCCCTGGGAGCACTT，用SYBR Green荧光染料进行适时定量PCR扩增。用18S做内参，通过Ct值比较不同组之间的基因相对差异性表达。

3 结果

3．1 组织砷蓄积 由表1可知相同含砷量的六神丸(200 mg/kg)在肝脏组织的蓄积量为260 ng/g大于雄黄(30 mg/kg)组 83 ng/g，而1/2含砷量的As5+组(44 mg/kg)肝组织砷蓄积却达到了3 560 ng/g，是六神丸的14倍。这表明六神丸复方可促进砷的吸收和向肝组织的分布，但其蓄积量远远小于As5+组。

表1 原子荧光法测得肝、肾、心组织中砷蓄积量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

表1 原子荧光法测得肝、肾、心组织中砷蓄积量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

注:与正常对照组比较，*P＜0．05。正常小鼠组织中含有微量(ng)砷，均在正常范围［5］。

组别 肝砷蓄积/(ng/g)肾砷蓄积/(ng/g)心砷蓄积/(ng/g)正常对照组六神丸组雄黄组As5+组蟾酥组76±6 261±24*83±7 3561±930*74±8 101±10 188±10*109±7 4 574±1 182*93±5 139±16 161±10 159±19 410±93*131±9

上述给药量的六神丸在肾脏组织的蓄积量(187 ng/g)略大于雄黄(108 ng/g)，而As5+组肝组织砷蓄积却达到了4 574 ng/g，是六神丸的16倍。同样，六神丸复方可以促进砷的吸收和向肾脏的分布，但其在肾组织的蓄积量远远小于As5+组。

六神丸和雄黄在心肌组织中蓄积很低，As5+组在心肌的蓄积量(410 ng/g)是六神丸的2．5倍，高于雄黄组(159 ng/g)。

3．2 血生化结果 AST和ALT及BUN是血液中分别反映肝、肾功能的客观指标，如表2显示，与正常对照组比，六神丸(200 mg/kg)、雄黄(30 mg/kg)、蟾酥(30 mg/kg)对血液中ALT、AST、BUN水平几乎没有影响，但As5+组明显升高血液中AST、ALT和BUN水平，结果有统计学意义。这说明六神丸、雄黄、蟾酥在上述剂量下对小鼠的肝肾功能没有明显的影响，而As5+却明显损伤肝肾功能。

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

注:*表示与正常对照组比较，P＜0．05。

组别 AST/(U/L) ALT/(U/L) BUN/(mmol/L)正常对照组274 ±33．8 47．5 ±6．6 10．2 ±0．4六神丸组 306 ±42．5 60 ±6．6 8．6 ±0．4雄黄组 367 ±58．2 76．8 ±6．3* 10．4 ±0．5 As5+组 507 ±118* 149 ±47．7* 22．4 ±4．3*蟾酥组320 ±47．3 75．2 ±6．3 9．7 ±0．8

3．3 病理学变化HE染色结果 由图1可知，六神丸组、蟾酥组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞形态正常，有少量的炎细胞侵润，雄黄损伤略重于六神丸，肝细胞嗜酸性变，轻微点状坏死。而As5+组肝小叶结构消失，肝细胞嗜酸性变、坏死，肝细胞点状坏死及间质内有炎性细胞侵润。

六神丸组、蟾酥组、雄黄组小鼠肾脏皮质部肾小球、肾小管结构完整，近曲小管管腔结构完整，无扩张，间质有少量炎性细胞侵润。As5+组肾小球毛细血管网结构破坏伴充血肿胀，肾小球球囊腔缩小，近曲小管肿胀，管腔结构消失，有炎性细胞侵润，肾小管上皮细胞点状坏死。

六神丸、雄黄对心肌组织几乎无损伤，而蟾酥对心肌组织有轻微损伤，引起心肌细胞的炎性细胞侵润，心肌间质充血及点状坏死，但程度较As5+组为轻，As5+组心肌组织细胞变性、坏死广泛，部分心肌细胞断裂，心肌纤维结构紊乱。

3．4 金属硫蛋白相对表达量 结果见表3。与对照组比，六神丸组几乎不上调肝组织中MT-2 mRNA的表达，蟾酥和雄黄组肝组织中MT-2 mRNA的表达量上升3～4倍，而As5+组肝脏中MT-2 mRNA的表达量则上升15倍之多。

图1 各组小鼠肝、肾、心组织病理学变化(HE染色，×100)Fig．1 Histopathology of liver(A，B)，kidney(C，D)and heart(E，F)arrows indicate necrosis(×100)

六神丸、雄黄和蟾酥组肾组织中MT-2mRNA的表达无明显变化，而As5+组肾脏中MT-2 mRNA表达量是对照组的26倍。

六神丸、雄黄组对心肌组织中MT-2 mRNA的表达均无影响。蟾酥组MT-2 mRNA的表达量是对照组的3倍，但无统计学差异，而As5+组心肌组织中MT-2 mRNA的表达量是对照组的180倍。此结果与组织病理学结果一致，表明蟾酥对心肌有轻微损伤，其损伤程度远小于As5+。

表3 组织金属硫蛋白M T-2 m RNA的相对表达量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

表3 组织金属硫蛋白M T-2 m RNA的相对表达量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

注:与正常对照组比较，*P ＜0．05。

组别 肝表达量 肾表达量 心表达量正常对照组六神丸组雄黄组As5+组蟾酥组100±40 113±81 438±161 1 465±609*333±163 100±46 76±26 79±18 2 558±691*91±23 100±58 98±45 48±25 18 130±6 258*311±79

4 讨论

六神丸是中国传统中药的四大名药之一，同药典中的其他23味中成药一样因含有雄黄其安全性受到了质疑，又因其含砷量超出国际标准而被国外禁止使用。新生儿及婴幼儿六神丸急性中毒均为一次口服引起。本实验以正常小鼠为对象，观察了单次口服给药后小鼠肝、肾和心肌组织内砷蓄积量，血液中肝肾功能指标的变化，肝、肾、心组织病理学改变及金属硫蛋白表达的变化，以上各个方面的结果均证明，六神丸及其组分雄黄、蟾酥毒性远小于无机砷化物As5+。

雄黄又名黄金石、石黄，为硫化物类矿物，主要成分是As4S4，雄黄是国务院在《医疗用毒性药品管理办法》特别规定的28种毒性中药之一［6］。药典曾两次降低雄黄的日用量，现为0．05～0．1 g，仍然大大超出国际标准。有研究表明通过六神丸组方配伍后，雄黄的毒性作用大大减弱［7］，在Beagle犬的毒性研究实验中证明六神丸全方对雄黄确实有减毒作用［8］。连续给予含雄黄的中药复方安宫牛黄丸8 h，其毒性远小于砷酸氢二钠(As5+)和亚砷酸钠(As3+)［5］。本实验结果显示，六神丸组含砷量与雄黄组相当，而其组织砷蓄积量大于雄黄组，表明六神丸可以促进砷的吸收和向组织分布，这也许与六神丸的药理作用有关。但六神丸对组织的毒性却并不大于雄黄，这可能正是中药复方的君、臣、佐、使奥妙之所在。同时，雄黄在肝、肾、心组织砷蓄积量远远小于As5+，血生化、病理学结果表明，雄黄对小鼠肝、肾、心的损伤程度远远小于As5+，其诱导肝、肾、心组织中的金属硫蛋白表达量也远远小于As5+，所以雄黄的急性毒性远远小于As5+，用总含砷量去评价雄黄的毒性是不科学的。

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物，长期过量服用会导致中毒［3，9］。Beagle 犬一次灌胃六神丸、六神丸去蟾酥和蟾酥，观察其急性毒性，结果显示，六神丸组和蟾酥组都出现了不同程度的心脏毒性，这表明六神丸全方对蟾酥并没有解毒作用［10］。本实验结果显示，蟾酥对小鼠心脏毒性大于肝肾组织，可以造成心肌细胞结构的破坏和形态的改变，但六神丸组未见明显的心脏损伤。本实验蟾酥用药量是临床日用量40倍，这提示，大量蟾酥可致心脏毒性，服用蟾酥一定不能过量，心脏功能不好者要慎用。六神丸的毒性不等于蟾酥的毒性，也不等同于蟾酥和雄黄毒性的简单相加。

金属硫蛋白(MT)是一类小的富含巯基的金属结合蛋白，其巯基可以螯合大量的金属离子后将其排出体外。MT可以被砷诱导生成，而MT的诱导产生可能是机体拮抗砷慢性毒性的一个细胞机制，可能在砷耐受中起适应性作用［11］，因此MT可以作为砷暴露的敏感指标，本实验在分子水平上通过real time RT-PCR检测MT-2 mRNA的表达，结果显示，临床用药量40倍的六神丸组、雄黄组、蟾酥组对肝、肾、心组织中的金属硫蛋白没有明显的诱导作用，而As5+组在肝、肾、心组织中都大量表达金属硫蛋白，这再次验证了砷蓄积、血生化和病理学结果。

六神丸是耳鼻喉科常备良药之一，在治疗多种疾病时都取得了良好的疗效［1-2］，而长期或大量服用六神丸引起的不良反应也时有发生，新生儿服用六神丸引起急性中毒大多数是由于服用过量所致［12-13］。本实验结果显示，给予40倍临床日用药量的六神丸，肝肾组织均有轻微的炎症反应，组织砷蓄积量也有所增加，这提示六神丸过量可以产生毒性，临床服用六神丸一定不要过量。雄黄和蟾酥都具有多方面的药理学作用，在治疗多种疾病时发挥着药理学效应，其在六神丸中所发挥的药理学效应及其相关的作用机理有待进一步研究。

砷毒性可因砷的价态，所处的形态不同而其毒性也大大不同［14］。本实验结果表明:六神丸对肝、肾、心组织急性毒性远小于As5+单体的毒性。其机制在毒代动力学上，雄黄在组织的砷蓄积量远小于As5+组。在毒效学方面，雄黄对炎症和金属硫蛋白的表达的影响远小于As5+组。因此，用总含砷量评价雄黄和六神丸的毒性是不科学的。

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