水蛭素对大鼠脑出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白claudin－5表达的作用

刘坤，姚阳

(沈阳医学院基础医学院生理学教研室，辽宁 沈阳 110034)

脑出血 (intracerebral hemorrhage，ICH)后脑水肿是ICH患者病情恶化和死亡的主要原因，凝血酶 (thrombin，TH)在ICH后脑水肿的形成中发挥重要作用。水蛭素是特异性的TH抑制剂，能与TH快速结合使其丧失活性［1］，因而具有减轻水肿的作用，但其具体机制尚不清楚。研究表明，TH与 ICH后的血脑屏障 (blood brain barrier，BBB)破坏有关，紧密连接相关蛋白claudin－5的表达与BBB的通透性改变密切相关。我们的研究旨在证明水蛭素是否可以通过调节claudin－5的表达，进而改变BBB通透性而减轻ICH后脑水肿的程度。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，体重260～300 g，沈阳医学院实验动物中心提供;戊巴比妥钠 (Sigma，美国);小鼠抗claudin－5单克隆抗体(Santa Cruz公司);山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的IgG二抗 (北京中山生物技术公司)，伊文思蓝 (Evans blue，EB，Fluka公司进口分装)，水蛭素 (上海太阳生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组 健康Wistar大鼠随机分为对照组、ICH组、水蛭素组。各组大鼠于术后48h取脑组织分别检测BBB通透性及claudin－5蛋白表达情况。各时间点均取20只大鼠分别进行各项检测。

1.2.2 动物模型制作 参照Rosenberg等的方法进行。大鼠经水合氯醛麻醉后，固定于立体定位仪上，行头部正中纵行切口，剥离骨膜暴露前囟和冠状缝。于前囟前0.2 mm，中线向右旁开3.0 mm处钻一直径1.0 mm小孔。ICH组大鼠用微量注射器从股动脉抽取适量血，在立体定向仪引导下经钻孔垂直进针，深度约6.0 mm(相当于右侧尾状核)，缓慢注血75 μl，留针10 min后退针并再注入3 μl生理盐水;水蛭素组注血75 μl后再注入含15 U水蛭素的生理盐水3 μl;对照组仅注入78 μl生理盐水。

1.3 检测指标

1.3.1 EB含量的测定 各组大鼠均于处死前1 h于股静脉注射2%EB 3 ml/kg。断头取脑组织，将其放入培养皿中，以防水分蒸发。取损伤区中心脑组织100 mg左右，称重后放入存有3 ml二甲基甲酰胺的试管中，60℃水浴中 (避光)抽提24 h。1 500g离心10 min，取上清，应用RF－540荧光分光光度计 (λ=632 nm)测定 EB荧光光度值(OD)，蒸馏水作为空白对照。根据光密度数值，从标准曲线上算出脑组织中EB含量，以EB含量(μg/g湿脑组织)代表BBB通透性的改变。

1.3.2 脑组织claudin－5蛋白表达 大鼠过量麻醉致死后，迅速断头，提取缺血区脑额顶叶组织蛋白，匀浆离心、测定蛋白浓度;蛋白分离采用10%十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecylsulfonate－polyacrylate gel electrophoresis，SDS－PAGE)电泳，转印到硝酸纤维素膜上;claudin－5(1∶500 稀释)、β－actin 抗体 (1∶5 000 稀释)，4℃孵育过夜;相应二抗室温孵育2h;增强化学荧光反应 (enhanced chemiluminescene，ECL)发光，采用Chemi Imager 5500V 2.03软件扫描胶片，Fluor Chem 2.0图像分析仪对条带积分光密度进行定量分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据以均数±标准差 (±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 BBB通透性改变 应用EB渗透性实验评估BBB通透性变化。与对照组相比，ICH组和水蛭素组脑组织EB含量于ICH后48 h时明显升高 (P＜0.01);水蛭素组脑组织EB含量低于ICH组(P＜0.01)(表1)。

图1 ICH后脑组织中claudin－5蛋白表达

2.2 脑组织claudin－5蛋白表达改变 与对照组相比，实验组ICH后48 h claudin－5蛋白表达明显减少 (P＜0.01);水蛭素组claudin－5蛋白表达高于ICH组 (P＜0.01)(图1，表1)。

表1 ICH后脑组织EB含量及claudin－5蛋白表达 (±s)

表1 ICH后脑组织EB含量及claudin－5蛋白表达 (±s)

注：1)与对照组相比，P＜0.01;2)与ICH组相比，P＜0.01

组别 EB含量 (μg/g) 相对光密度值(claudin－5/β－actin)对照组0.189±0.021 0.581±0.153 ICH组 0.773±0.0161) 0.165±0.0311)水蛭素组 0.415±0.0181)2) 0.390±0.0531)2)

3 讨论

TH是一种多功能丝氨酸蛋白酶，由无活性的凝血酶原活化而来。研究表明，TH在ICH后脑水肿形成过程中起关键作用。TH的特异性抑制剂水蛭素可以有效抑制这种脑水肿的发生。目前认为，后期脑水肿 (出血后24 h以后)主要与TH破坏BBB有关。亦有研究表明，ICH后24～48 h时脑水含量最多，这时 BBB通透性达到峰值［2，3］。因此，本研究取ICH后48h这一时间点观察水蛭素对BBB及紧密连接蛋白claudin－5表达的影响。

内皮细胞间的紧密连接是构成BBB的重要部分。跨膜蛋白claudins是紧密连接复合物的主要构成成分，参与维持紧密连接的选择渗透性和细胞极化［4］。其中，claudin－5是脑血管内皮细胞通透性调节的最重要调节因子［5］，因此，claudin－5对BBB通透性可能起着至关重要的调节作用。本研究发现，ICH后48 h，BBB通透性显著升高，水蛭素可以降低ICH后期BBB的通透性;同时claudin－5表达显著减少，水蛭素可使 ICH后期claudin－5表达明显增加。这一结果提示，水蛭素可能通过上调claudin－5表达，使BBB通透性降低，从而减轻ICH后期的脑水肿程度。

TH对细胞作用是通过与细胞膜结合的TH受体 (thrombin receptor，TR)介导的。TH可通过激活 TR引起酪氨酸酶的活化，再激活GTP结合蛋白 RhoA［6］，RhoA 激活导致 claudin－5 表达减少［7］。Ishizaki等的研究证明，cAMP可以通过依赖或非依赖蛋白激酶A途径，通过苏氨酸磷酸化而上调猪BBB上chudin－5的表达，从而促进内皮细胞上紧密连接的功能［8］。TH与其受体结合导致细胞内cAMP浓度降低［9］，因而具有下调claudin－5表达的作用。TH是一种重要的前炎症因子，可上调炎 性 细 胞 因 子 的 表 达，如 IL－1、TNF－α［10］。Kawakita等研究发现TH可促进MMP－9的表达和激活［11］。这些因子的表达和激活均能引起claudin－5表达减少［12，13］。我们推测，水蛭素可能通过与TH结合，抑制其对酪氨酸酶的活化及对炎性因子和MMP－9的调节，增加claudin－5的表达，使紧密连接关闭，BBB通透性下降，而发挥减轻脑水肿的作用，其具体作用机制有待进一步研究。

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