TopoIIα在胃癌组织中的表达与临床意义

李晓燕 高天慧 李林蔚 刘明月

胃癌是我国最常见肿瘤之一，目前据Parkin报道其发生率位居第四位，死亡率仅次于肺癌占第二位［1］。手术是主要的治疗措施，但由于早期诊断率低，大多数患者失去手术机会，胃癌的复发与转移是胃癌治疗失败的主要原因之一［2］，因此化疗在胃癌治疗中处于非常重要的地位。有试验研究表明:TopoIIα在胃癌组织中的高表达与胃癌的发生发展以及多种抗肿瘤药物作用机制有关，并且与多药耐药有关。本研究应用免疫组织化学方法，检测了胃癌中TopoIIα的表达，旨在探讨其与胃癌的临床病理特征的关系，指导胃癌化疗及耐药。

1 资料与方法

1.1 标本 收集河南省人民医院病理科2008年10月至2010年10月间89例胃腺癌手术切除石蜡标本，取20例癌旁正常胃组织作为对照组，原发性胃癌的组织学分类标准参照2000年WHO胃癌组织学，均为胃腺癌，根椐2003年国际抗癌联盟(UICC)和2010美国肿瘤联合会(AJCC)联合制定的TNM分期标准进行临床分期。

1.2 仪器与试剂 BP121S型分析天平、病理石蜡切片机、电热恒温培养箱、低温冰箱、医用烧烤微波炉、自动染片机、自动脱水机、微量吸管、光学显微镜、镜下图像以Olympus Dp70图像采集分析仪进行采集、分析。

TopoIIα(产品编号:MAB-0588)，试剂盒选用即用型MaxVision检测试剂盒，对二甲氨基偶氮苯(DAB)显色剂，均购自福州迈新生物技术开发公司。酒精、二甲苯、苏木素等试剂由河南省人民医院病理科提供。

1.3 试验方法 ①常规石蜡标本切片:使用切片机将本研究中所有石蜡包埋标本进行切片，所有切片厚度为3～5 μm;②标本脱蜡至水:脱蜡前标本置于60℃恒温箱20 min。在二甲苯及梯度乙醇中脱蜡水化(二甲苯10 min×2次，无水酒精5 min×2次、90%酒精5 min×1次、75%酒精5 min×1次);③TopoIIα采用柠檬酸高温修复，37℃水浴箱内孵育30 min;④PBS液冲洗3 min;⑤阻断内源性过氧化物酶活性:H2O2100 ml+CH3OH 900 ml液避光室温浸泡10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，然后蒸馏水冲洗2 min×1次，PBS冲洗2 min×3次;⑥PBS冲洗3次滴加TopoIIα 40～50 μl，4℃冰箱过夜;⑦冰箱内取出标本，PBS冲洗2次，滴加即用型MaxVision检测试剂40～50 μl，室温下40 min;⑧DAB显色:每张切片加两滴新鲜配制的DAB，在显微镜下控制显色(5～15 min);⑨自来水冲洗;苏木素复染30 s，盐酸酒精分化;自来水冲洗;⑩脱水、透明:95%乙醇5 min×1次;70%乙醇5 min×1次;无水酒精5 min×2次;二甲苯10 min×2次;○11封片:切片干燥后，用中性树胶封固，干燥后显微镜下观察。

1.4 结果判断 每批实验均设阳性和阴性对照，TopoIIα表达阳性可见细胞核有棕黄色颗粒样沉淀，阴性细胞核无棕黄色颗粒样沉淀。染色分级整张切片无阳性细胞(-)，阳性细胞数＜10%(+)，阳性细胞数10% ～50%(++)，阳性细胞数≥50%(+++)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TopoIIα在胃癌中的表达。见图1，表1。TopoIIα在胃腺癌中的表达为53.9%(48/89)。在正常胃组织中的表达为0%。

图1 TopoIIα在胃癌中的表达

表1 TopoIIα表达与胃癌临床病理参数之间的关系(例，%)

2.2 TopoIIα表达与胃癌临床病理特征间的关系，表1。TopoIIα表达与患者性别、年龄、肿瘤大小无显著性相关，而与肿瘤部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期相关，且在胃贲门处表达高于胃底部，随着分化程度的增加、淋巴结转移的增多及肿瘤分期的增加其TopoIIα的表达增强。

3 讨论

DNA拓扑异构酶(Topo)普遍存在于各类生物种群中，包括病毒、原生动物、真菌、植物、昆虫、两栖类、鸟类及哺乳动物的正常和肿瘤细胞中，参与细胞有丝分裂过程中的DNA转录、重组、复制及染色体分离［3-4］，是调节核酸空间结构动态变化，控制核酸生理功能的关键酶。DNAToPoll主要在细胞核内发挥生理作用。TopoII又称回旋酶，最早发现于1980年，是与细菌DNA回旋酶(gyrase)具有同源性的二聚体蛋白。人类的 TopoⅡ有两种同工酶，为 TopoIIα和 TopoIlβ。TopoIIα由17号染色体编码，TopoIlβ则由3号染色体编码，两者均可与DNA形成稳定的共价复合物。TopoIlα大多位于增殖细胞中，而且在快速增殖细胞中的水平是静止细胞中的数倍，在细胞内主要分布于细胞核浆，并多呈网状结构聚集在染色体着丝粒周围［5］。TopoIlα参与 DNA的转录、翻译、复制及染色体的分离等过程，主要存在于S2、G2/M期，有两种功能:一作为细胞的增殖指数，表达于S2、G2/M期;二作为抗癌药物的靶点指数。同时研究发现在肿瘤组织中，TopoIIα的表达增高是一个普遍现象，而且临床方面已逐渐将TopoIIα作为判断细胞或肿瘤增殖程度的一个标志［6-8］;并且，许多研究发现 TopoIIα 表达与患者的预后有关［9，10］。亦有研究表明，TopoIlα阳性表达与腋窝淋巴结转移和肿瘤远处转移有关［11］。Varis［12］和 Wikman［13］分别发现，在胃癌和肺癌中TopoIlα的增殖比Her-2更常见。

本研究中TopoIIα的阳性表达率为53.9%，与胃癌的部位有关，胃贲门癌TopoIIα的阳性表达率较高;与胃癌组织的分化程度、淋巴结转移及胃癌分期相关，低分化者表达显著高于高中分化，胃癌分期越晚其表达越高，提示组织分化越差，分期越晚，说明其恶性程度高，细胞增殖活跃，存在于S2、G2/M期的TopoIIα量多，阳性率就高，同时也提示耐药性越低，对化疗药物敏感性高。

TopoII为靶点的抗癌药较多，根据作用方式不同分为嵌入型和非嵌入型两类。嵌入型抑制剂系通过其分子中类似嘌呤碱或嘧啶碱的多环结构嵌到TopoⅡ与DNA结合部位的双链之间，从而干扰了该酶将DNA断端重新接合的正常功能，并进一步造成DNA链断裂损伤，导致细胞死亡这一类药物有葱环类抗生素如阿霉素，柔红霉素，放线菌素，米托蒽醌，安吖啶，咔唑类等［14］。非嵌人型抑制剂其作用模式还不十分楚，可能是直接作用TopoⅡ或是仅仅与双链DNA中的一条链结合以影响酶功能。这一类药物依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide)等。一般认为TopoII阳性表达越高，化疗药物具备的靶点越多，对抗癌药物敏感性越高。

TopoⅡ抑制剂引起的由ToPon介导的MDR不典型多药耐药(at-MDR)。主要表现在以下几方面:①TopoIIα基因的位点突变或缺失;②TopoIIα的磷酸化水平提高，已经证实，TopoIIα的高磷酸化与它的催化活性及易解离复合物形成呈负相关;③TopoIIα基因调控异常导致TopoIIα蛋白水平降低。临床上对肿瘤细胞的治疗中如不了解基因TopoIIα水平，盲目使用抗肿瘤药，易导致肿瘤细胞抗药性的产生，影响疗效。

4 小结

胃癌的发生和发展是多因素、多阶段的综合结果，本研究发现TopoIIα与胃癌的部位、淋巴结转移、远处转移、临床分期等因素有关。而DNA拓扑酶抑制剂开辟了肿瘤治疗的新途径，其具体疗效还需要进一步的临床试验研究。TopoⅡ抑制剂引起的由TopoII介导的不典型多药耐药(at-MDR)在胃癌的研究中有待于进一步的试验研究。

［1］孙燕，石远凯.临床肿瘤内科手册.北京:人民卫生出版社，2008:476.

［2］高进.中国癌症侵袭与转移研究的回顾和展望.中华肿瘤杂志，2001，23(4):265-268.

［3］Champoux J J.DNA topoisomerases:strueture，funetion，and mechanism Annu.Rev.Bioehem，2001，70:369-413.

［4］Li，T K，Liu L F.Tumor cell death induced by topoisomerase targeting drugs.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol，2001，41:53-77.

［5］Wang LD，Zheng S，Zheng ZY，et al.Primary adenocarinomas of lower esophagus，esophagogastric junction and gastric cardia:in special reference to China.World J Gastroenterol，2003，9(6):1156-1164.

［6］Nakopoulou L，Lazaris AC，Kavantzas N，et al.DNA Topoisomerase II alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer.Pathobiology，2000，68(3):137-143.

［7］Willman JH，Holden JA.Immunohistochemical staining for DNA Topoisomerase II-alpha in benign，premalignant，and malignant lesions of the prostate.Prostate，2000，42(4):280-286.

［8］Stathopoulos G P，Kapranos N，Manolopoulos L，et al.Topoisomerase II alpha expression in squamous cell carcinomas of the head and neck.Anticancer Res，2000，20:177-182.

［9］Gotlieb WH，Goldberg I，Weise B，et al.Topoisomerase II immunostaining as a prognostic marker for survial in ovarian cancer.Gynecol Oncol，2001，82(1):99-104.

［10］Provencio M，Corbacho C，SaIas C，et al.The Topoisomerase II alpha expressioncorrelates with survival in patients with advanced Hodgkin’s lymphoma.Clin Cancer Res，2003，9(4):1406-1411.

［11］Camiglio M，Somenzi G，Olgiati C，et al.Role of proliferation in Her-2 status predicted response to doxorubicin.Int J Caneer，2003，105:568-573.

［12］Varis A，Wolf M，Monni O et al.Targets of gene amplification and overexpression at 17q in gastric cancer.Cancer Res，2002，62:2625-2629.

［13］Wikman H，Kettunen E，Seppanen JK et al.ldentification of differentially expressed genes in pulmonary adenocarcinoma by using cDNA array.Oncogene，2002:21:5804-5813.

［14］Brana MF，Cacho M，Gradillas A，et al.Intercalators as anticancer drugs.Curr Pharm Des，2001，7(17):1745-1780.