Spoligotyping结合多位点PCR用于牛分枝杆菌卡介苗的快速鉴定*

张媛媛 ,黄明翔 ,赵秀芹,张丽水,刘志广,万康林

2.福建福州肺科医院 福州350001

卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin,M.bovis BCG)是上世纪初期法国科学家Calmette和Guérin从牛乳中分离出的牛分枝杆菌(M ycobacterium bovis,M.bovis),经13年 230代的传代培养制成的减毒活疫苗。我国从上世纪50年代开始新生儿接种卡介苗工作,是我国儿童计划免疫中历史最悠久、接种人数最多的疫苗之一。公认地,卡介苗可以有效地降低儿童原发性结核、结核性脑膜炎、粟粒型结核的发生,但是自2007年以来,我国有多篇文献报道由于疫苗误种或不规范接种导致的儿童卡介苗病[1-3],甚至导致儿童死亡[4]。但是,这些病例全部是由临床症状和流行病学资料诊断的临床卡介苗病例,缺乏实验室证据支持。本研究采用传统的细菌学菌种鉴定技术和两种分子生物学技术对从临床诊断的一例儿童全身播散性BCG病病例的分离的菌株进行了鉴定,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 结核分枝杆菌H 37Rv,牛分枝杆菌93006,田鼠分枝杆菌ATCC19422,非洲分枝杆菌ATCC25420,鸟分枝杆菌ATCC25291,胞内分枝杆菌 ATCC13950,耻垢分枝杆菌ATCC19420,为本实验室保藏株;临床分离菌株和注射用卡介苗均由福建省福州肺科医院检验科提供。

1.2 临床病例及其流行病学资料[4]由福建福州肺科医院医生根据患儿临床症状、相关实验室检查,包括:淋巴穿刺液细菌培养,涂片显微镜检查以及血常规检测和影像学检查等,做出疾病临床诊断,流行病学资料通过询问患儿家长收集。

1.3 鉴别培养基培养与药敏试验 以无菌手续研磨临床分离菌株的菌块,并稀释成1mg/m L的菌悬液,分别接种于对硝基苯甲酸(4-Nitrobenzoic acid,PNB)培养基、噻吩-2'-羧酸肼(2-Thiophenecarboxylic acid hydrazide,TCH)培养基、含甘油的罗氏(L-J)鸡蛋培养基以及吡嗪酰胺(Pyrazinam ide,PZA)药敏培养基各6支,培养基制备方法参照《结核病诊断细菌学检验规程》[5]。分别置于25℃,42℃,37℃培养,每周观察结果至少两次,当培养基斜面上有肉眼可见菌落时,记录结果;观察8周仍无肉眼可见菌落的培养管记为培养阴性。

1.4 Spoligotyping[6-7]PCR扩增DR区,将 PCR产物与固定于Biodyne C膜上的43个寡核苷酸探针进行杂交,用CDP-star检测,采集杂交信号,根据杂交信号的有无判定菌种类型。

1.5 多位点PCR[8]根据结核分枝杆菌核酸序列选择七个在结核分枝杆菌复合体中分布具有差异的基因设计引物[8],选择了一个分枝杆菌属特异16srRNA编码基因和六个结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tubercu losis Comp lex,M tbC)菌种间具有不同分布的基因片段,分别是:Rv0577,IS1561',Rv1510,Rv1970,Rv3877/8,Rv3120。采用CTAB法粗提分枝杆菌核酸做为PCR反应模板,94℃预变性5m in,94℃变性1m in,60℃退火1m in,72℃延伸1m in,30个循环,最后72℃延伸 10min,1%琼脂糖凝胶电泳,观察PCR产物及其长度,以标准菌株作对照,进行结果判断。

2 结 果

2.1 临床诊断与流行病学资料 患儿于出生当日接种卡介苗,3月后发现左腋窝淋巴结肿大并化脓,局部穿刺脓液涂片检抗酸杆菌(4+),培养出抗酸杆菌,无结核病接触史,予3HRZ/9HR方案治疗(方案说明:3、9为用药月数,H为异烟肼Isoniazid,R为利福平Rifam picin,Z为吡嗪酰胺Pyrazinam ide),局部反复抽脓、异烟肼脓腔注射冲洗,愈合良好后出院。1年后因左腋下淋巴结脓肿复发,并出现全身感染症状,再次入院,临床诊断为:全身播散性感染,全身多发结核性淋巴结炎,肺结核,伴病毒感染,免疫功能低下。

2.2 培养试验 患儿淋巴穿刺液接种于普通L-J培养基,生长3周后,有肉眼可见菌落生长,分离株被命名为FJ07111。在37℃条件下,FJ07111在含甘油的L-J鸡蛋培养基上和PZA培养基上生长良好,而PNB和TCH培养基上均不生长,25℃、42℃培养条件下均无菌落生长。见表1。其生长特性与牛分枝杆菌一致。

表1 FJ07111在不同培养条件下的生长结果Tab le1 The culture resu lt under different culture conditions of FJ07111

2.3 Spoligotyping FJ07111和福建BCG疫苗株(M.bovis BCG)所有43个位点的杂交结果完全一致,第39-43位点未检测到杂交信号,而33～38位点检测到杂交信号。阴性对照(无菌蒸馏水)无杂交点产生,其余结核分枝杆菌临床分离菌株(Mycobacterium tuberculosis,M tb)均缺失第33,34号位点的杂交信号。见图1。

2.4 多位点PCR PCR扩增结果可见结核分枝杆菌具有全部的七个基因,牛分枝杆菌缺失Rv1510、Rv1970和Rv3120,而 BCG在此基础上还缺失了Rv3877/8,同样地,田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌和非结核分枝杆菌也具有不同的PCR扩增图谱,见图2。

3 讨 论

某些免疫抑制病人可由于接种卡介苗而感染卡介苗病,尤其是某些新生儿可因此发生严重的淋巴结结核,或者是全身性结核病[9-10]。为进一步区分,由BCG引起的结核病被统称为BCG病[9-10]。但是由于卡介苗的生长特性与牛分枝杆菌非常相似[11],传统的生化反应,培养特点,药敏试验均不能将它们加以区分,因此很多卡介苗病的确诊缺乏实验室证据。

传统细菌学鉴定是我国《结核病细菌学检验规程》[5]上明确规定的M.bovis鉴定方法。本研究中,临床分离菌株FJ07111在PNB和 TCH培养基上不生长,而在含有甘油的L-J鸡蛋培养基和PZA的药敏培养基上生长良好,这是因为M.bovis对PNB和TCH敏感,而对PZA天然耐药,因此传统的细菌学鉴定结果证明FJ07111是M.bovis,并且由于其在含有甘油的L-J培养基上生长良好提示它可能是M.bovisBCG。Spoligotyping是一种以PCR为基础的方法,该方法稳定、敏感性好、特异性高,被广泛地应用于结核分枝杆菌复合体菌株的株水平的鉴定[6-7]。大量的菌株鉴定结果证实所有的M.bovis和M.bovisBCG都缺乏39～43间隔区而含有33～38间隔区,因此可以从结核分枝杆菌复合群中分辨出M.bovis和M.bovis BCG,但这种方法还不能从M.bovis中区分M.bovisBCG[7]。而多位点PCR则是今年来发展起来的一种更为简单快速的菌种鉴定方法[8]。比较基因组学研究结果揭示:RD 1区(regions of difference,RD)缺失被认为是M.bovis变异为M.bovis BCG过程中主要的衰变事件(attenuation event),因为所有的卡介苗菌株都具有这种缺失[12],这一位点就是本研究中的第6号引物所指向的位点,在注射用BCG和FJ07111中扩增结果均为阴性,而其他M tbC菌株中均为扩增阳性。在对长序列多态性(long sequence polymorphism s,LPs)的PCR分析中发现有些 RD位点对于一个M tbC菌株或其亚种是具有唯一性的(有或无),还有一些则是在 M tbC菌种中具有不同的分布[13]。我们的实验结果与文献报道完全一致,证实了这些位点的组合在M tbC菌种间确实具有很好的区分能力,而且这种方法在获得纯培养菌株之后,仅需数小时即可获得结果,操作简便、需要的仪器和试剂容易获得,因此这种方法具有良好的实验室应用前景。

本研究将传统的细菌学菌株鉴定技术和分子生物学技术相结合,成功地将临床分离M.bovis菌株鉴定为M.bovisBCG,不仅为临床确诊提供了直接证据,还为未来的实验室检测鉴定BCG提供了可靠的技术方案。研究结果提示传统的细菌学菌株鉴定技术虽然耗时费力,但是它对于操作技术的要求不高,所需的实验条件在一般的临床实验室都可达到,仍然是我国绝大部分临床实验室的主要鉴定方法。而分子生物学方法则具有快速、简便、准确、敏感、特异的特点,但是正是由于其敏感度很高,极易由于交叉污染而产生假阳性结果,造成误诊,因此开展分子生物学技术的实验室应该严格控制实验流程。总之,设计合理的菌种鉴定分子生物学方法实验流程,建立标准化操作步骤(Standard Operation Procedure,SOP),不仅为我们深入了解结核病的致病菌菌种类型提供了准确的方法,为临床确诊提供直接证据以指导临床治疗,还可以进行分子流行病学调查和研究,能够为制定有效的控制和治疗策略提供科学依据。

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