沙眼衣原体感染小鼠生殖道模型的初步研究*

王乐丹,颜林志,孟锐锋,张丽芳

2.温州医学院基础医学院,温州 325000

沙眼衣原体感染小鼠生殖道模型的初步研究*

王乐丹1,颜林志1,孟锐锋2,张丽芳2

目的建立沙眼衣原体(Ct)小鼠生殖道感染模型。方法分别用106、104、102数量IFU的CtE型株阴道内接种雌性BALB/c小鼠,观察外阴炎症反应,检测排菌情况,PCR检测分泌物及对组织进行病理观察。结果接种后第5d,实验组小鼠即出现感染迹象;在接种后的5～20d均可在小鼠生殖道分离得到具感染性的Ct,但其持续排菌时期与接种的IFU数量成正比;且小鼠生殖道排菌量(IFU)与接种的IFU数量亦成正比,以106剂量组为高;小鼠生殖道分泌物PCR扩增后电泳,可见与CtMOMP分子量相当的产物;小鼠生殖道组织切片观察证实,CtE型株感染小鼠生殖道可产生生殖道炎症。结论成功建立了小鼠生殖道E型Ct感染模型;l06IFU是建立模型的适宜感染量。

沙眼衣原体;动物模型;生殖道感染

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是最常见的性传播疾病病原体之一,它在泌尿生殖系统引起多种器官的感染甚至导致不孕不育,然而其致病机制目前尚未完全明了。建立合适的动物模型对研究Ct致病机制、免疫、以及该病原体治疗、药物疗效及毒性观察、疫苗研究等方面有着重要意义,而国内有关研究报告甚少,特就建立Ct小鼠生殖道感染模型作初步研究。

1 材料与方法

1.1 菌株CtE型株购自ATCC,含RPMI-1640生长培养基和蔗糖谷氨酸钾稀释液(SPG)。

1.2 动物6～8 w雌性BALB/c小鼠40只,购于温州医学院动物实验中心,均为清洁级,体重18～24g,随机分为4组,每组10只,分笼颗粒饲料饲养并标记,饲养在温州医学院动物实验中心清洁级动物房,温度保持在18℃～24℃,光暗周期 12h。

1.3CtE型株体外培养、制备感染液 用CtE型株感染Hep-2细胞,在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养,收集单层感染Hep-2细胞,胰酶消化后反复冻融3次使细胞破碎,1 000r/min,离心10min沉淀细胞碎片,收集上清,并在4℃30 000r/min,继续离心60min,取沉淀即为纯化的Ct,用SPG置-70℃保存。

1.4Ct滴度的测定 在6孔细胞培养板中预置盖玻片,将Ct接种于细胞单层,待包涵体形成后进行Giemsa染色,高倍镜下(40×)观察,镜下计数50个视野,计算平均值,然后乘以654,既得全孔包涵体数目,并通过直线回归推算出未稀释时包涵体密度,即IFU/mL的数值[1-2]。

1.5 感染动物 4组(每组10只)BALB/c雌性小鼠在接种标本前先用无菌干棉签阴道口旋转几次以扩开阴道口。随机选取1组作为对照组,用培养Ct所用Hep-2细胞悬液(无Ct感染)50μ L接种,小鼠取倒置位15min,防止液体从阴道内流出。另外3组随机同法分别用含102、104、106IFU 的Ct感染液50μ L 接种。

1.6 感染观察

1.6.1 炎症反应 观察小鼠外阴有无红肿、分泌物有无增加、分泌物颜色有无异常,并将实验组和对照组进行比较。

1.6.2 排菌检测 分别在感染后第5d、10d、15d、25d及30d,对所有小鼠取阴道宫颈拭子行病原学Hep-2细胞培养分离Ct,并进行IFU计数。Ct培养平均IFU评分:4,＞104IFU;3,103～104IFU;2,102～103IFU;1,＜102IFU;0,阴性。每组取 10只小鼠的平均值。采用Fisher's检验方法对实验数据进行统计处理。

1.6.3 阴道分泌物中CtDNA的PCR检测 根据Ct主要外膜蛋白DNA序列,设计引物:正向5′ACTAGTggATCCT T GCC AtggCT T Tg AgT TCT gC 3′,反向 5′GGTCTAGAAAgCT TgAAgCg gAA TTg TgC AT T TAC g 3′,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将-70℃保存的Ct裂解煮沸处理后取0.5μ L作为模板扩增,同法将Hep-2细胞收集液处理后作阴性对照。93℃预变性5min,93℃变性30s、55℃复性30s、72℃延长 1min共40个循环。循环结束后,72℃延伸10min后终止反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6.4 病理观察 于感染攻击后第10d(取完阴道宫颈口拭子后)处死小鼠每组3只,解剖取出完整的生殖系统标本。迅速放入10%福尔马林固定剂中,经固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、染色,中性树胶封片,晾干保存。

2 结 果

2.1 炎症反应 经阴道接种感染后第5d,实验组小鼠即出现感染迹象:外阴与阴性对照组相比见有红肿,分泌物增加,如图 1。

图1 Ct感染组小鼠外阴炎症变化注:Pre Ct为小鼠生殖道感染Ct前照片Fig.1 The appearance of genital inflammation in Ct infected-mice

2.2 排菌检测 分别用 102、104、106IFU的CtE型株接种小鼠,发现在接种后的5～20d均可在小鼠生殖道分离得到具感染性的Ct,但其持续排菌时期与接种的IFU 数量成正比,分别为20、15、10d;且小鼠生殖道排菌量(IFU)与接种的IFU数量亦成正比,以106剂量组为高,具体结果见表1。

表1 雌性BALB/c小鼠阴道内感染不同滴度Ct结果比较Table1 Intravaginal infection of BALB/c mice with various amounts of Ct

2.3 PCR检测阴道分泌物 小鼠生殖道分泌物PCR扩增后电泳,可见与CtMOMP分子量相当的产物,见图2。

2.4 小鼠生殖道Ct感染后生殖器官病理改变 见图3。

由上述病理切片可见,小鼠生殖道Ct感染后,输卵管管壁慢性炎细胞浸润、粘膜皱襞消失而变得平坦、薄,部分可见皱襞残留;子宫内膜间质浆细胞、淋巴细胞浸润,伴不同程度的水肿充血;宫颈间质内淋巴细胞和浆细胞等慢性炎细胞浸润,产生了输卵管炎、子宫内膜炎、宫颈炎等病状。实验证明106IFU接种剂量可使BALB/c小鼠感染Ct,成功建立小鼠Ct生殖道感染模型。

图2 目的片段Ct MOMP PCR产物电泳分析1:Hep-2细胞感染小鼠分泌物PCR产物;2、3:Ct感染小鼠分泌物PCR产物;4:DL2000 ladderFig.2 PCR analysis of Ct MOMP1:Secretion PCR product of Hep-2 infection;2、3:Secretion PCR product of Ct infection;4:DL2000 ladder

图3 各组小鼠输卵管及子宫颈病理改变比较(3.1-3.6)3.1:对照组输卵管;3.2:Ct感染组输卵管(积水明显);3.3:对照组子宫;3.4:Ct感染组子宫;3.5:对照组子宫颈;3.6:Ct感染组子宫颈Fig.3 The pathological changes of tubal and cervical in different mice groups(3.1-3.6)

3 讨 论

Ct是性传播疾病(STD)最常见的病原体之一,目前,Ct生殖道感染的发病率持续上升,在一些西方发达国家和国内沿海地区其发病率已位居性传播疾病之首。虽然Ct感染生殖道在人体所引起的临床症状较轻、不典型,但发病机理复杂[3],而且因医学伦理等问题,在人体研究其致病机理受到限制。所以动物模型的建立有利于发病机理、疫苗的免疫效应和保护效应、药物的疗效和毒性等研究。国外已有研究发现,利用小鼠建立鼠型Ct生殖道感染模型与女性Ct生殖道感染非常相似,而且具有多重优势,适用于免疫学研究和对Ct感染引起的繁殖力变化的研究[4]。

但在小鼠Ct生殖道感染模型的构建中,存在着许多影响因素,如小鼠种系、小鼠周龄、小鼠动情周期、感染Ct数量和接种方法等均对感染成功有影响。不同小鼠种系对Ct生殖道感染的敏感性不同,有学者对比BALB/c、C3H/HeN和C57BL/6 3种小鼠,认为C3H/HeN和C57BL/6小鼠对Ct感染的敏感性最高,BALB/c次之[5]。处于性活跃期的6～8w年幼成年鼠最容易感染成功[6]。这可能是多因素结果:性生理改变,免疫力成熟,多次暴露后的获得性免疫等。随着年龄的增长,年长成年鼠由于性和/或免疫机制成熟导致的生理改变在对衣原体感染的抵抗增强上起到重要的作用。在人群调查研究发现,Ct感染在性活跃的成年妇女中有较高的感染率,随着年龄的增长,Ct感染率逐渐下降[7]。

关于Ct的感染剂量:Ct感染模型的实验数据很大程度上受到Ct感染剂量的影响,感染剂量的多少直接影响到模型建立是否能够成功。目前众多文献中所报道的感染剂量数量级,从104～107不等。一般来说,建立动物模型时,达到同样的感染率,鼠型Ct比人型株Ct所需的感染剂量小[8]。对于适宜的感染浓度,陈木开等[9]研究发现,鼠型Ct进行小鼠阴道内接种时,用105IFU以下Ct阴道内接种,不能使感染组小鼠出现明显发病,而用105和107IFu接种小鼠,小鼠出现明显发病,电镜观察到Ct存在于输卵管病变组织。106IFU为合适的感染剂量。由此可见小鼠生殖道感染模型的建立受多方面因素的影响,不同的实验室间也存在一定的差异,因此本部分小鼠生殖道感染模型的建立工作,对于本研究准确评价衣原体疫苗的免疫效果和保护性作用是非常必要的。

[1]王红枫,刘全忠,齐蔓莉.沙眼衣原体 E血清型的小鼠生殖道感染模型初步研究[J].中华皮肤科杂志,2006,39(5):296-297.

[2]Li Z,Wang S,Wu Y,et al.Immunization with Chlamydial plasmid protein pORF5 DNA vaccine induces protective immunity against genital chlamydial infection in mice[J].Sci China C Life Sci,2008,51(11):973-80.

[3]陈辉,杨斌,郑和平,等.泌尿生殖道沙眼衣原体分子流行病学研究进展[J].岭南皮肤性病科杂志,2009,16(1):72-74.

[4]王红枫,刘全忠.沙眼衣原体生殖道感染动物模型的研究进展[J].国外医学皮肤性病学分册,2005,31(2):127-129.

[5]Maza LM,Pal S,Khamesipour A,et al.Intravaginal inoculation of mice with the Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis biovar results in infertility[J].Infect Immun,1994,62(5):2094-2097.

[6]Pal S,Peterson EM,Maza M,et al.Susceptibility of mice to vaginal infection with Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis is dependent on the age of the animal[J].Infect Immune,2001,69(8):5203-5206.

[7]Wallin K L,Wiklund F,Luostarinen T,et al.A populationbased prospective study of Chlamydia trachomatis infection and cervical carcinoma[J].Int J Cancer,2002,101(4):371-374.

[8]Perry IL,Su H,Feilzer K,et al.Difierential sensitivity of distinct Chlamydia trachomatis isolates to 1FN-gamma-mediated inhibition[J].Inmmno1,1999,162:3541-3548.

[9]陈木开,韩建德,陈小红,等.MoPn沙眼衣原体致小鼠生殖道感染模型的初步研究[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(8):687-689.

Preliminary study on the murine model for genital infection withChlamydia trachomatis

WANG Le-dan,YAN Lin-zhi,MENG Rui-feng,ZHANG Li-fang
(The2nd Af filliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou325000,China)

In order to found the murine model for genital infection withChlamydia trachomatis(Ct),female BALB/c mouse was inoculated with E-type strainCtby 106,104and 102IFU respectively.The inflammatory response,bacteriological yields,secretion PCR and histopathological change were observed.Five days after inoculation,inflammatory response emerged in experimental group,and hyperinfectiveCtcould be available in mouse's genital tract.The duration ofCtexcretion was closely in line with IFU quantity of inoculatedCt,and the quantity ofCtexcretion was also proportional to IFU amount.Secretion PCR could also get the similar molecular product,and the pathological reproductive tract infection was confirmed.In conclusion,mouse model ofCtgenital infection has been found successfully and 106IFU is the suitable amount for that.

Chlamydia trachomatis;animal model;genital infection

R374.1

A

1002-2694(2011)08-0692-04

*国家自然科学基金(30972669),温州市科技局科研基金(Y20080119,Y20100090)资助项目

张丽芳,Email:wenzhouzlf@126.com

1.温州医学院附属第二医院,温州 325000;

2.温州医学院基础医学院,温州 325000

2011-01-18;

2011-04-23