天山雪莲培养物对辐射损伤的保护功能研究

刘雅萍，陈晓霞，刘汉石

(大连普瑞康生物技术有限公司，辽宁 大连 116001)

天山雪莲Saussurea involucrateKar.Et Kir.系菊科风毛菊属植物，主产于新疆天山、昆仑山，是具有重要药用价值的名贵中草药。由于天山雪莲生长环境特异，人工栽培困难，加之过度采挖，目前该物种濒临灭绝［1、2］。为解决珍稀濒危药用植物的资源问题，本公司利用从中国科学院植物研究所转化的天山雪莲细胞大规模培养技术，经多年研究实现了天山雪莲细胞的产业化培养，生产出有效成分含量高、产量大的天山雪莲培养物。

天山雪莲素有“雪山花王”之称，生长在低温、风大、紫外辐射强的高原雪线以上地区，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效［3］。有研究表明，雪莲花水提取物对辐射损伤有保护作用［4］，但对天山雪莲培养物辐射保护能力评估的研究极少。本研究通过辐射损伤小鼠模型来探讨天山雪莲培养物对辐射损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 样品

普瑞康牌雪神胶囊由大连普瑞康生物技术有限公司生产(批号20050501)，其每粒配方为天山雪莲培养物12mg，淀粉288mg，每次4粒，每天2次。

1.2 动物

昆明种清洁级雌性小鼠192只，由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供(许可证号SCXK-京 2004-0001)，体重 20g±2g。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器 E400生物显微镜(2005011);755紫外光栅分光光度计(2002001)，MEK-6318K血液分析仪(2004012)。

1.3.2 试剂 Hank’s液、Giemsa染液、小牛血清、1/15mol·L－1磷酸盐缓冲液(pH6.8)及 SOD 试剂盒(批号20051010)。

1.4 方法［5］

1.4.1 剂量 实验设人体推荐剂量的5倍、10倍、30 倍，即每日 0.2g/kg BW、0.4g/kg BW、1.2g/kg BW(相当于每日 8mg/kg BW、16mg/kg BW、48mg/kg BW天山雪莲培养物)，为低、中、高剂量组。受试物用无菌水配制，每日1次，经口给予，连续灌胃30 d后辐照动物，辐照后仍然给予受试样品。小鼠灌胃体积为0.1mL/10g鼠量。同时设一辐射模型对照组，用无菌水代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。

1.4.2 对小鼠白细胞计数的影响 受试样品组小鼠于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量60Co-γ射线全身照射1次，照射剂量选择3Gy。分别于照射前、照射后第3天、照射后第 14天 3次取血 20μL，用 MEK-6318K血液分析仪进行白细胞数测定。

1.4.3 对小鼠骨髓细胞微核的影响 受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均同一剂量γ射线全身照射1次，照射剂量选择3Gy。于照射后第3天颈椎脱臼杀死动物，取股骨用止血钳挤出骨髓液与玻璃片一端的小牛血清混匀，常规涂片。涂片自然干燥后，放入甲醇中固定 10min，放入 Giemsa应用染液中，染色25min，立即用磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。镜检每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。

1.4.4 对小鼠血中超氧化物歧化酶活性的影响 (1)受试样品组照射前后经口给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一计量γ射线全身照射1次，照射剂量选择7 Gy。于照射后7 d进行试验;(2)红细胞抽提液制备，10 μL全血冲入0.5 mL生理盐水，2000 r·min－1离心 3 min弃上清，速混合器抽提 1 min，4000 r·min－1离心 3 min分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，上清液体积为0.26 mL，待测;(3)SOD活力测定，参照试剂盒说明书严格操作。

1.4.5 血清溶血素(半数溶血值)实验 受试样品组照射前后经口给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射1次，照射剂量选择1 Gy。于照射后第11天进行实验。每只小鼠腹腔注射0.2 mL绵羊红细胞(SRBC)(2%v/v)进行免疫。4 d后摘除眼球取血，放置1 h后将凝固的血与SA缓冲液稀释(200倍)。取稀释后血清 1.0 mL，SRBC(10%v/v)0.5 mL，补体 1.0 mL 加入同一离心管中。另设不加血清的对照管(以 SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温15 min后，冰水浴终止反应。2000 r·min－1离心10 min。取上清液1.0 mL、都氏试剂 3.0 mL于试管内，同时取SRBC(10%v/v)0.25 mL 加都氏试剂到 4.0 mL 作为半数溶血管。各试管充分混匀，放置10 min后于540 nm处以对照管作为空白，分别测定各管光密度值。半数溶血值按下式计算:

1.5 数据处理

用SPSS软件进行数据处理。计量资料采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 ＜F0.05。结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。计数资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 天山雪莲培养物对辐射后小鼠白细胞计数的影响

表2显示，各实验组小鼠辐射后第3天外周血白细胞数与辐照前比较显著降低(P＜0.01)，说明造摸成功。辐射后第3天，48mg/kg BW组与0 g/kg BW组比较，外周血白细胞数有极显著差异(P＜0.01);辐射后第 14天，48mg/kg BW 组与 0 g/kg BW组比较，外周血白细胞数有显著性差异(P＜0.05)。其他各给药组动物外周血白细胞数也有一定的提高，但无显著性差异，提示天山雪莲培养物可有效提高辐射损伤模型小鼠外周血白细胞数。

表2天山雪莲培养物对辐射后小鼠外周血白细胞计数的影响(±s)

表2天山雪莲培养物对辐射后小鼠外周血白细胞计数的影响(±s)

注:与0 g/kg BW 组比较:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01与辐射前自身比较:△ P≤0.05，△△P≤0.01

组别及剂量 例数 辐射前(×109·L－1)辐射后第3d(×109·L －1)辐射后第14 d(×109·L －1)3.6 ± 0.8 8mg/kg BW 12 6.7 ±1.0 1.9 ± 0.4△△ 4.2 ±0.9 16mg/kg BW 12 6.9 ±1.1 2.1 ± 0.5△△ 4.4 ±0.7 48mg/kg BW 12 6.8 ±1.1 2.4 ± 0.6＊＊△△ 4.7 ±0.9 0mg/kg BW 12 6.6 ±1.5 1.7 ± 0.5△△*

2.2 天山雪莲培养物对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响

表3显示，辐照后第3天，48mg/kg BW 组与0 g/kg BW组比较，骨髓细胞微核率有显著性差异(P＜0.05)，其他各给药组无显著降低，提示天山雪莲培养物可降低辐射损伤模型小鼠骨髓细胞微核率。

表3天山雪莲培养物对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响(±s)

表3天山雪莲培养物对辐射小鼠骨髓细胞微核率的影响(±s)

注:与 0 g/kg BW 组比较:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01

组别及剂量 例数 微核数(个) 骨髓细胞微核率(‰)0 mg/kg BW 12 194 16.2 8mg/kg BW 12 190 15.8 16mg/kg BW 12 169 14.1 48 mg/kg BW 12 155 12.9*

2.3 天山雪莲培养物对辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影响

表4显示，辐照后第7天，48mg/kg BW 组与0 g/kg BW组比较，小鼠血中超氧化物歧化酶活性有显著差异(P＜0.05)，即天山雪莲培养物在48mg/kg BW组可提高辐射损伤模型小鼠血中超氧化物歧化酶活性。

表4 天山雪莲培养物对辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影响(±s)

表4 天山雪莲培养物对辐射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影响(±s)

注:与 0 g/kg BW 组比较:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01

组别及剂量 例数 血中SOD活性(U·g－1Hb)0 mg/kg BW 12 8354±2320 8mg/kg BW 12 10024±2369 16mg/kg BW 12 10238±2118 48 mg/kg BW 12 10923±2065*

2.4 天山雪莲培养物对辐射后小鼠血清溶血素的影响

表5显示，辐照后第11天，各剂量组辐射后小鼠血清溶血素与0 g/kg BW组相比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即天山雪莲培养物对辐射损伤模型小鼠血清溶血素无影响。

表5天山雪莲培养物对辐射后小鼠血清溶血素的影响(±s)

表5天山雪莲培养物对辐射后小鼠血清溶血素的影响(±s)

组别与剂量 例数 半数溶血值0 mg/kg BW 12 94.5 ±21.8 8mg/kg BW 12 101.3 ±27.2 16mg/kg BW 12 112.0 ±25.6 48 mg/kg BW 12 117.8 ±26.3

3 讨论

辐射对机体的损伤主要表现在对血液系统、免疫系统的损害和诱导细胞癌变等方面［6］，特别是造血系统，它对辐射高度敏感［4］。然而，对于植物雪莲对辐射损伤保护作用的研究多集中在免疫系统方面［6-8］。本研究从血液系统、染色体及氧化还原反应系统3个方面，分别考察了天山雪莲培养物对辐射损伤的保护作用。实验结果显示，48mg/kg BW组能提高辐射后第3天辐射损伤模型小鼠外周血白细胞数(P＜0.01)，提高辐照后第14天辐射损伤模型小鼠外周血白细胞数(P＜0.05)，降低辐射损伤模型小鼠骨髓细胞微核率(P＜0.05)，提高辐射损伤模型小鼠血中超氧化物歧化酶活性(P＜0.05)，且对小鼠体重增长无不良影响。

天山雪莲培养物是选取优质野生天山雪莲细胞，经多年优选细胞继代培养而成，具有主要有效成分含量高、生长周期短等优点。据报道，苞叶雪莲水提物用量在0.75 g/kg BW时能量提高辐射损伤小鼠的白细胞数［10］，而天山雪莲培养物做为普瑞康牌雪神胶囊的主要成分，在48mg/kg BW剂量时具有明显的抗辐射损伤作用，其作用可能是源于天山雪莲培养物中的总黄酮和多糖等成分具有强大的抗氧化、抗自由基作用［9］，还有待进一步研究证实。

4 结论

天山雪莲培养物具有明显的抵抗辐射损伤引起的白细胞降低、髓细胞微核率提高和SOD活性降低的作用。

(致谢:本研究实验数据由北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心提供)

［1］李 燕，郭顺星，王春兰，等.天山雪莲细胞培养物化学成分研究［J］.中国药学杂志，2007，42(23):1768.

［2］申 毅，邹建华，马英丽，等.雪莲内酯类成分的研究［J］.中国中药杂志，2009，34(24):3221.

［3］李君山，陈虎彪，蔡少青，等.新疆风毛菊属新植物［J］.植物研究，1997，17(1):39.

［4］高 博，梁中琴，顾振纶.天山雪莲水提取物对小鼠辐射损伤的保护作用［J］.中草药，2003，34(5):443.

［5］保健食品检验与评价技术规范［S］.2003版.

［6］王 沛，白芬兰，张宇辉，等.雪莲对核辐射损伤作用的研究［J］.解放军医学高等专科学校学报，1999，27(1):23.

［7］王 沛，杨继红，王雁军.雪莲对正常及辐射损伤小鼠巨噬细胞功能的影响［J］.中国微生态学杂志，1998，10(1):32.

［8］王 沛，白丰沛.雪莲对正常的与辐射损伤的小鼠细胞免疫功能的影响［J］.佳森林斯医学院学报，1996，19(2):8.

［9］高 博，梁中琴，顾振纶.天山雪莲水提取物抗辐射损伤作用的机理研究［J］.江苏医药杂志，2003，29(1):17.

［10］徐进彦，李文辉，刘建波，等.苞叶雪莲水提物对小鼠辐射防护作用研究［J］.中国辐射卫生，2008，17(4):403.