医院感染铜绿假单胞菌β-内酰胺酶基因型分析

王 杨,高 辉,黄云昆,付晓野,徐 敏

(昆明市延安医院检验科,云南昆明 650051）

铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa,PA）广泛分布于自然界,属于条件致病菌,在正常人体内很少致病,却是医院感染的重要病原菌之一。随着新型广谱抗菌药物的广泛应用,PA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性日益严重,限制了抗生素的选择,给临床抗感染治疗带来了极大的困扰。该研究收集临床标本中分离的20株PA,通过研究其β-内酰胺酶基因型及耐药性特点,为进一步研究昆明地区PA耐药基因的分布情况奠定基础,为减少耐药PA的产生、提高临床抗感染治疗效果提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2009年6月-2009年10月昆明市延安医院(三甲医院）临床标本中分离的非重复性PA20株。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 药敏纸片和培养基

16种药敏纸片种类详见药敏结果表中所列,亚胺培南、美洛培南、环丙沙星、为英国Oxoid公司产品,其余药敏纸片为北京天坛药物生物技术开发公司产品。药敏试验用M-H培养基,为英国Oxoid公司产品。

1.3 细菌鉴定与药敏试验

用法国生物梅里埃VITEK32细菌鉴定仪进行细菌鉴定,药敏试验采用K-B琼脂扩散法,按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS）的标准判读药敏试验结果。

1.4 提取细菌基因组DNA

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA,按试剂盒说明书操作,试剂盒由天根生物技术有限公司生产。

1.5 检测β-内酰胺酶基因

用Biometra Personal Cycler PCR仪扩增7种β-内酰胺酶基因,PCR扩增引物由北京百泰克生物技术有限公司合成,7种靶基因引物序列见表1[1]。PCR扩增体系均为 :2 ×Taq Master Mix 25 μ L,模板 0.5 μ L,P1 引物2 μ L,P2 引物 2 μ L,无菌去离子水补足至50 μ L(Taq PCR MasterMix购自北京博迈德科技发展有限公司）。热循环参数均为:94℃2 min,然后94℃60 s→55℃60 s→72℃60 s,循环35个周期,最后72℃10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,Bio-Rad Laboratories 6000凝胶成像系统观察结果,并摄像保存。

表1 PCR引物序列

1.6 基因序列测定与分析

β-内酰胺酶基因扩增的阳性产物经纯化后,用ABI 377全自动DNA序列分析仪进行序列测定,所测序列用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST进行序列比对和同源性分析。

2 结果

2.1 药敏试验结果

20株PA对16种抗菌药物的敏感性,见表2。

2.2 β-内酰胺酶基因PCR检测结果

20株PA均检测出TEM 基因,而SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1基因扩增均为阴性。

2.3 序列分析及比对

本研究对6个菌株的TEM基因PCR阳性产物进行双向测序,共测得523个核苷酸。该序列与β-内酰胺酶TEM-1的编码基因(GenBank注册号:NC013365.1）同源性为99%。

3 讨论

PA是医院感染的重要病原菌之一,其对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性呈逐年上升趋势。研究发现,PA对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制是细菌产生各种 β-内酰 胺酶(β-lactamases,BLA）,β-内酰胺酶基因可由质粒介导,通过转化、转导、结合、传递等方式在同种或不同种属菌株间转移和传播,造成院内感染流行[2]。在各个国家和地区流行的BLA基因型各有不同[3-5]。

该研究中的20株PA均检测出TEM-1型β-内酰胺酶基因,与国内其他地区的检测结果有一定差别[6,7]。导致菌株β-内酰胺酶基因携带率不同的原因可能与菌株来源(地理位置）和各地区医院抗菌药物的使用习惯不同有关。TEM-1是革兰阴性菌中最常见的一种广谱β-内酰胺酶(SBL）,能水解青霉素和低代头孢菌素如头孢噻吩和头孢噻啶等。在新一代抗生素选择性压力等因素的影响下,细菌的β-内酰胺酶基因突变,可由广谱酶TEM-1、2发生1-5个氨基酸改变而衍生出超广谱β-内酰胺酶(ESBLs）,能水解广谱青霉素、第三代头孢类及单环类抗生素,目前已发现了160种TEM型衍生酶,呈酸性,等电点为5.2-6.5,其中大部分是ESBLs[8-11]。药敏结果显示本组PA对β-内酰胺类抗菌药物都有不同程度的耐药,尤其对氨曲南和头孢哌酮的耐药率更分别高达45%和75%,携带TEM-1基因可能是本组PA对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要原因之一。而昆明地区PA的β-内酰胺酶基因型除TEM-1型外,是否存在其它基因型别,其流行率如何,课题组正在进行深入研究。

此外,药敏试验显示,该组PA不仅对β-内酰胺类药物耐药,对β-内酰胺酶抑制剂、碳青霉烯类、磺胺类和喹诺酮类等其他抗菌药物也存在很高的耐药率。PA表现为多重耐药,其机制非常复杂,研究发现细菌可通过基因变异或基因水平转移获得耐药基因,除产生各种β-内酰胺酶,还可产生抗生素修饰酶、外排泵高表达、药物作用靶位改变和外膜通透性改变等。PA对同一种类抗菌药物的耐药通常不是由单一因素造成的,而是几种机制协同作用的结果,其对不同种类抗菌药物的耐药机制也各有不同,还不断有新的耐药机制出现,而且同一菌种在不同地区、不同时期其耐药性和耐药基因的携带状况也不尽相同[12-15]。因此,检测当地PA的耐药率及耐药基因流行情况,对于及时发现突变株,指导临床合理使用抗生素,预防和控制感染具有重要意义。

[1]常 东,蒋 伟,魏 华,等.多重耐药铜绿假单胞菌产超广谱β-内酰胺酶基因研究[J].中华医院感染学杂志,2006,16(9）:961.

[2]Bradford PA.Extended spectrumβ-lactamases in the 21st Century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].ClinMicrobiol Rev,2001,14(4）:933.

[3]Coque TM,OliverA,Perez JC,et al.Genes encoding TEM-4,SHV-2,and CTX-M-10 extended-spectrum beta-lactamases are carried by multiple Klebsiella pneumonise clones in a single hospital[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46:500.

[4]Radice M,Power P,Conza JD,et al.Early dissemination of CTX-M-derived enzymes in south America[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2）:602.

[5]Munday CJ,Xiong J,Li C,et al.Dissemination of CTX-M type beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolates in the People's Republic of China[J].Int J Antimicrob Agents,2004,23(2）:175.

[6]王春新,糜祖煌,黄支密,等.中国部分地区铜绿假单胞菌β-内酰胺酶基因型研究[J].中国抗生素杂志,2008,33(3）:164.

[7]陈贤君,李克诚,韩立中,等.产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌的基因型研究[J].检验医学,2007,22(3）:283.

[8]钟运华,何 林,周克元,等.超广谱β-内酞胺酶研究进展[J].国际检验医学杂志,2008,29(3）:252.

[9]张 玲,黄留玉.革兰阴性杆菌产超广谱β-内酰胺酶研究进展[J].中华医院感染学杂志,2008,18(6）:897.

[10]Patricia A,Bradford.Extended spectrum β-Lactamases in the 21st century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].Clinical Microbiology Reviews,2001,14(4）:933.

[11]Varsha G.An update on newer β-lactamases[J].Indian J Med Res,2007,11:417.

[12]Zavasck AP,Carvalhaes CG,Picao RC,et al.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2010,8(1）:71.

[13]Poirell L,Weldhagen GF,Dechamps C,et al.A noso-comial outbreak of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the extended-spectrum betalactamase GES-2 in South Africa[J].J Antimicrob Chemother,2002,49(3）:561.

[14]Castanheira M,Toleman MA,Jones RP,et al.Molecular characterization of a β-lactamases gene,blagim-1,encoding a new subclass of metallo-βlactamases[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12）:4564.

[15]Normark BH,Normark S.Evolution and spread of antibiotic resistance[J].J Intern Med,2002,252(2）:91.