丹参多酚酸盐对匹鲁卡品致痫大鼠BDNF表达的影响

陈丽丽,黄靓妹,詹红艳,曹亦宾,史 楠,黎 洁,王丹丹

(唐山工人医院 1.神经内科;2.急诊内科,河北 唐山 063000）

脑源性生长因子(BDNF）是神经生长因子家族的一员,研究发现BDNF与癫痫密切相关,组织缺血缺氧后脑内BDNF释放量明显增多,且对癫痫有保护作用。丹参多酚酸盐注射液是国家二类中药新药。自2005年5月获批应用以来,证实它具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善微循环、抗氧化损伤的作用。本课题拟采用免疫组织化学方法观察匹鲁卡品(PILO）所致大鼠脑内BDNF的表达,探讨丹参多酚酸盐干预注射后对大鼠脑内BDNF的表达影响。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性成年Wistra大鼠15只,体重200-250 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将动物置于20℃、安静的环境中饲养。匹鲁卡品(PILO）,美国SIGMA公司;,兔抗大鼠BDNF多克隆抗体与SABC免疫组化试剂盒,均由武汉博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将大鼠随机分为(1）丹参多酚酸盐干预组5只,用2%戊巴比妥钠0.1 ml/50 g将大鼠麻醉,固定于立体定位仪上,按大鼠解剖图谱取前囟后2.0 mm、左旁开1.0mm,钻开颅骨,校准微量进样器,抽取10 mg/kg,垂直进针至硬脑膜下3.5 mm(左侧脑室）,注射完毕后拔出进样器,撒上青霉素粉预防感染,缝合皮肤后放回饲养笼内;第二天先腹腔注入东莨宕碱1 mg/kg,以拮抗其外周胆碱能反应,半小时后腹腔注射匹鲁卡品(PILO）350 mg/kg。(2）生理盐水干预组5只,用相同的方法侧脑室注入等量生理盐水,第二天腹腔注射PILO350 mg/kg。(3）对照组5只,给大鼠腹腔注射等量的生理盐水。观察上述各组大鼠有无癫痫发作。

1.2.2 标本处理 将实验动物在腹腔给药后12小时麻醉,固定在立体定位仪上,剪开胸腹腔,暴露心脏、肝脏,自心尖向右上45°进针至主动脉起始端。快速灌注生理盐水100 ml后接4%多聚甲醛(PF）200ml灌注。若大鼠出现四肢僵直、肝脏变白立即停止灌注。剪开颅骨,取中脑至小脑之间的脑组织,放入4%PF后固定2小时,最后移入30%蔗糖溶液4℃过夜。

1.2.3 冰冻切片 将脑组织修材并固定于基座上,自中脑向后行20 μ m冠状连续切片,并放入磷酸盐缓冲液中用于BDNF免疫组化。

1.2.4 BDNF的SABC免疫组织化学染色 组织片飘浮于PBS配制的1%H2O2中,室温下10 min消化内生过氧化物酶,PBS 5 min/次洗 2次;然后按SABC免疫组织试剂盒说明进行染色。用PBS取代一抗作阴性对照。置换试验用正常兔血清代替兔抗大鼠BDNF多克隆抗体。BDNF阳性细胞计数:在光学显微镜下,每组随机抽取5张切片6个高倍视野。计算海马CA1区高倍视野下的BDNF阳性细胞数。

1.3 数据分析

所有数据采用SPSS 13.0进行统计分析。数据表示为¯x±s。BDNF阳性细胞均数各组间比较行t检验,统计显着性为P＜0.05。

2 结果

2.1 行为学观察

根据Racine[1]制定的标准判定癫痫发作:Ⅰ级:面部阵挛;Ⅱ级:面部阵挛+节律点头;Ⅲ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛;Ⅳ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立;Ⅴ级:面部阵挛+节律点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒。5只盐水干预组大鼠在注射PILO后10-20分钟均可见癫痫发作。但丹参多酚酸盐组有4只大鼠在注射PILO后30-40分钟见癫痫发作,但程度较弱。对照组无癫痫发作。

2.2 BDNF免疫组化结果

各组海马CA1区BDNF阳性细胞数(见表1）,生理盐水及丹参多酚酸盐干预组均可见到颗粒细胞及椎体细胞中的BDNF的表达。NS、丹参多酚酸盐干预组BDNF阳性细胞数高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05）;而且丹参多酚酸盐组高于生理盐水组,差异有统计学意义(P＜0.05）。BDNF阳性细胞数形态见图1。

表1 各组海马 CA1区BDNF阳性细胞数(±s）

表1 各组海马 CA1区BDNF阳性细胞数(±s）

注:*与对照组比较(P＜0.05）,差异有统计学意义;#与NS组比较(P＜0.05）,差异有统计学意义。

组别 n BDNF阳性细胞数NS干预组 5 14.520±2.836*丹参多酚酸盐干预组 5 25.631±3.154*#对照组 5 8.625±1.175

图1 BDNF阳性细胞数形态(BDNF免疫组化染色,×400）

3 讨论

脑源性生长因子是神经生长因子家族中的一员,它是1982年从猪脑中分离到的,由120各氨基酸残基组成的细胞外因子。BDNF除了对特异性神经元的存活、鉴别和维持其功能方面起作用外,也对突触递质有急性的敏锐的兴奋作用,能调节神经递质的释放、诱发谷氨酸受体翻译后调节。神经元内BDNF主要定位于细胞体和轴突,海马颗粒细胞轴突苔状纤维有明显的BDNF免疫活性。在中枢神经系统中,轴突是 BDNF发挥作用的主要部位。Tsankora[2]等研究发现,癫痫持续发作后海马、内嗅皮层、杏仁核、外周皮层中BDNF的表达明显增高。本研究中,生理盐水及丹参多酚酸盐干预组均可见到颗粒细胞及椎体细胞中的BDNF的高表达,这与文献报道一致。Vezzami[3]等研究发现:在癫痫发作后100分钟时,BDNF的免疫反应性在海马CA1区、齿状回和内嗅皮层内显著升高。林卫红[4]等在大鼠杏仁核点燃癫痫模型中,发现大鼠颞叶和海马BDNF的表达随着癫痫发作次数的增加而增高。有人对癫痫发生过程中BDNF增高的机制进行了研究,在海人藻酸(Kainic acid KA）诱导的癫痫模型中发现依赖Ca2+/钙调蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ的抑制剂KN-62能阻断痫后BDNF mRNA水平的升高,这说明依赖Ca2+/钙调蛋白的蛋白激酶Ⅱ、Ⅳ是引起癫痫发作后BDNF mRNA水平升高的一个必要环节。Hagihara等[5]研究发现匹鲁卡品诱发的癫痫模型中BDNF的高表达具有促进新生神经细胞增殖的作用。

丹参能缓解缺血脑组织单胺类神经递质和神经肽的紊乱,减少痫样放电,抑制脑缺血所致的β-脑啡肽异常升高,减轻脑损伤和脑水肿[6]。丹参多酚酸盐注射液主要是丹参的水溶性活性成分,具有改善微循环、抗氧化损伤、提高惊厥阈的作用,可通过多途径发挥细胞保护作用,促进内皮细胞迁移,促进血管生成[7]。癫痫发作引起内源性BDNF蛋白的表达增强,与兴奋-抑制性神经递质GABA-Glu平衡失调而致的兴奋性增高密切相关,这些变化可能是导致神经损伤的重要因素。本研究中,侧脑室注入丹参多酚酸盐后腹腔注射PILO,丹参多酚酸盐干预组BDNF的表达更多,细胞着色更深。丹参多酚酸盐能明显降低急性癫痫痉挛性大鼠的发作等级和发作时间,可能与调节神经GABA-Glu的失衡,促进神经元修复有关,使癫痫发作后海马区BDNF的表达增高,产生特异性抑制神经元损伤的作用。其具体作用机制和作用途径有待进一步研究。

[1]Racine RJ,Gartner JG,Burnham WM.Epileptifor m activity and neural plasticity in limbic structures[J].Brain Res,1972,47:262.

[2]Tsankora NM,KumarA,Nestler EJ.Histone modifications at gene promoter regions in rat hippocampus after acute and chronic electroconvulsive seizures[J].J Neurosci,2004,24(24）:5603.

[3]Vezzami A,Ravizza T,Moneta D,et al.Brain-derived neurotrophic factor immunor eactivity in the limbic system of rats afteracute seizures and during spontaneous conrulsions:temporal evolution of changes as compared to neuropeptide Y[J].Neuroscience,1999,90(4）:1445.

[4]林卫红,孟红梅,吕玉丹,等.BDNF及其受体TrkB在实验性癫痫中的作用及意义探讨[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2007,14(1）:11.

[5]Hagihara H,Hara M,Tsumekawa K,et al.Tonx-clonic seizures induce division of neuronal progenitor cells with concomitant changes in expression of neurotrophic factors in the brain of pilocarpine treated mice[J].Brain Res Mol Brain Res,2005,139(2）:258.

[6]刘宝军,刘 峰,高 云,等.慢性癫痫大鼠海马谷氨酰胺合成酶的改变及丹参对其的影响[J].河北医科大学学报,2005,26(2）:131.

[7]黄秋玲,唐洪丽.丹参注射液对发育期癫痫大鼠脑源性神经生长因子影响[J].江西中医药,2010,41(5）:72.