外阴鳞状细胞癌患者癌组织VEGF、Bcl-2基因启动子的DNA甲基化及其表达

文京华，李伯埙，黄小平，江卫红，朱彦菲，李武县

(1深圳市福田区第二人民医院，广东深圳518049;2西安交通大学医学院附属第二医院;3深圳市人民医院)

外阴鳞状细胞癌(VSCC)是较少见的恶性肿瘤，多见于60岁以上妇女，其病因及发病机制尚未完全明确。近年研究发现，表观调控机制在肿瘤的发生机制中起重要作用。为探讨VSCC的发病机理，我们检测了VSCC患者癌组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bcl-2基因启动子的甲基化及其表达。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2006年1月～2011年1月在深圳市福田区第二人民医院和西安交通大学医学院附属第二医院行手术治疗的8例VSCC患者，年龄(43.5±9.6)岁;均经病理检查证实，其中高分化3例，中分化2例，低分化3例;有、无淋巴结转移各4例;临床分期Ⅰ～Ⅱ期5例，Ⅲ～Ⅳ期3例。患者均未接受过放、化疗。

1.2 检测方法 取8例患者的癌组织及毗邻正常皮肤组织(正常组织)手术标本，检测其VEGF、Bcl-2基因启动子的DNA甲基化及其表达。

1.2.1 DNA甲基化免疫共沉淀—实时定量聚合酶链反应技术检测DNA甲基化 参考文献［1］方法，并进行部分改良。即取VSCC及正常组织各25 mg，在液氮中用BioPulverizer粉碎机破碎，抽提DNA;用超声处理细胞悬液4 min，破碎后，取部分检测破碎效率，确定基因组DNA片段为200～1 000 bp。向超声后的各EP管中加入稀释缓冲液，使其体积均为700 μl，再加入蛋白 G 磁珠悬液 60 μl，4 ℃、垂直混匀器上混匀1 h;将上述EP管置于磁力架中，放置10 min以上，溶液完全澄清后，将上清转移至新的EP管中;加热95℃、10 min后，加入5-甲基胞嘧啶抗体8 μg，4℃、垂直混匀器上孵育过夜;加入偶联二抗兔抗IgG磁珠，4℃、垂直混匀器上孵育2 h;分别用预冷的三种溶液各1 ml，在4℃下依次洗涤Protein G-抗体-DNA复合物，洗完后将EP管放到磁力架上，放置10 min，直至磁珠全部被吸附到管壁上，上清澄清后弃上清;用洗脱液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、1%SDS)400 μl洗涤，向洗脱的MeDIP DNA中加入等体积酚—氯仿溶液抽提DNA。

采用ABI 7700 Realtime PCR仪对免疫沉淀的DNA、未加5-甲基胞嘧啶抗体和偶联二抗磁珠的DNA、阴性对照进行扩增;测定标准曲线和熔解曲线，用Ct值表示样品中模板的相对含量，用2－△△CT法进行分析。实时定量PCR反应体系及扩增条件:PCR 反应体积25 μl，含10 × buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2溶液 1.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl，10 μmol/L特异性上下游引物各1 μl(上海生工公司合成)，10 ×Sybergreen 工作液 0.625 μl，Taq 酶 1 U，DNA模板1 μl。扩增条件为:预变性95℃ 4 min，94 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，81 ℃ 15 s，共40个循环。基因扩增引物序列为:VEGF F:5'AGTAAGAGTTT TAGAGAGAAGTCGA3'，R:5'AACGATATCTATCTATCTATCCGTC3';Bcl-2 F:5'TATTATAAGTTGTCG TAGAGGGGTTAC3'，R:5'CGACTAAATAAAACGTATACCCGAA3'。

1.2.2 实时定量逆转录 PCR 采用 Trizol抽提RNA，琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，紫外分光光度计测定A260/A280比值;鉴定RNA纯度及定量后，将合格的RNA逆转录成cDNA，4℃保存待用。采用Prime5.0统计软件分析设计引物序列及管家基因GAPDH(略)，荧光定量PCR反应体系及扩增条件与MeDIP-qPCR相同。测定标准曲线和熔解曲线，用Ct值表示样品中模板的相对含量，用2－△△CT法［2］进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量数据用±s表示，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织的VEGF、Bcl-2甲基化改变 VSCC患者癌组织的VEGF、Bcl-2基因甲基化分别为0.71±0.03、0.76±0.05，正常组织分别为0.98±0.02、1.04±0.03;癌组织的 VEGF、Bcl-2 甲基化程度均低于正常组织(P均＜0.05)。

2.2 不同组织的VEGF、Bcl-2 mRNA表达 VSCC患者癌组织的VEGF、Bcl-2 mRNA表达分别为2.58±0.04、1.01±0.03，正常组织分别为 2.31±0.02、0.96±0.03;癌组织的 VEGF、Bcl-2 mRNA 表达均高于正常组织(P均＜0.05)。

3 讨论

DNA甲基化是目前研究的热点之一，最近大量研究显示，DNA甲基化异常参与肿瘤的发生、发展［2，3］。肿瘤血管生成受多种血管生成因子和血管生成抑制物调控，VEGF是其中心调控因子。VEGF是一种高度保守的糖蛋白，能直接促进血管生成，增强血管内皮细胞表达黏附分子，通过纤维蛋白溶解酶系统及金属蛋白酶，降解细胞外基质，促进肿瘤浸润和转移［4］。Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，其编码产物Bcl-2蛋白可抑制细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控。本研究显示，VSCC患者癌组织的VEGF、Bcl-2基因启动子呈DNA低甲基化，且低甲基化的 VEGF、Bcl-2 mRNA表达增加。VEGF mRNA高表达可促进VSCC的癌组织血管生成，有利于VSCC生长、转移;Bcl-2 mRNA高表达可导致细胞凋亡受阻，促进VSCC的癌组织细胞增殖。

综上所述，本研究认为VEGF、Bcl-2基因启动子DNA低甲基化可能参与VSCC的发生、发展，其DNA甲基化改变可能可作为VSCC潜在的生物标记物及其表观治疗靶点。

［1］Pulmke N，Santacruz D，Walter J.Comprehensive analysis of DNA-methylation in mammalian tissues using MeDIP-chip［J］.Methods，2011，53(2):175-184.

［2］Watanabe Y，Maekawa M.Methylation of DNA in cancer［J］.Adv Clin Chem，2010，52:145-167.

［3］Huang L，Frampton G，Liang LJ，et al.Aberrant DNA methylation profile in cholangio-carcinoma［J］.World J Gastrointest Pathophysiol，2010，15(2):23-29.

［4］Fondevila C，Metges JP，Foster J，et al.p53 and VEGF express ion are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer［J］.Br J Cancer，2004，90(1):206-215.