新型基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的增强效应

余 钢，陈 捷

(南昌大学第一附属医院，南昌 330006)

单克隆抗体(Abs)是新一类抗癌方法，可以提高某些恶性肿瘤如乳腺癌、结肠癌等的治愈率，缓解肿瘤进展时间，但其抗肿瘤的疗效还不十分理想。采用基因工程技术将Abs进行重组，并克隆到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达为所需的抗体分子，可提高其抗肿瘤疗效。该法具有免疫原性低、效价高、成本低等优点。现结合文献就近年来几种新型基因工程抗体的特性及临床应用综述如下。

1 IgG1分子内修饰

1.1 Fc片段中氨基酸修饰 许多临床预实验研究已经表明，抗体依赖性细胞毒(ADCC)是抗体抗肿瘤机制中的重要一项，例如利妥昔单抗、曲妥单抗和一种抗CD52单克隆抗体阿仑单抗［1］。因此，在开发研制新一代具有更强大治疗作用的治疗性抗体方面，增强ADCC活性可能会成为一条重要途径。

通过修饰改变Fc片段中的氨基酸序列可增强ADCC活性。Stavenhagen等［2］通过一种独特的酵母显示系统已筛选出许多广泛的Fc突变，并发现具有5处突变的变异体与FcrRⅢa受体的结合力增加了10倍，这些变异体在B细胞淋巴瘤荷瘤鼠模型体内展现出更强的抗肿瘤作用。EphA2属于Eph络氨酸激酶受体家族(RTKs)中的一员，并过表达于多种肿瘤，如胸腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、食管癌、神经胶质瘤等。EphA2同时也在原发性肿瘤新生血管系统中的内皮细胞上表达，因此通过抑制血管生成来达到靶向治疗可能为实体肿瘤的治疗提供新的途径。

Bruckheimer等［3］通过置换抗EphA2抗体中的3处氨基酸获得突变型抗EphA2抗体，该抗体在体外较无突变抗体的杀肿瘤细胞作用增强，肿瘤细胞杀伤率约为80%，并在SCID荷瘤鼠(体内含有功能性NK细胞和单核细胞)模型中同样表现出更强地抑制肿瘤生长的疗效。Bruckheimer还发现，其在非肥胖糖尿病SCID荷瘤鼠(体内无功能性NK细胞和单核细胞)模型中也有抑制肿瘤生长的作用，因此认为抗EphA2抗体除了通过ADCC作用杀伤肿瘤细胞外，还利用了EphA2受体激活所介导的抑制肿瘤生长的作用。

1.2 Fc片段中低聚糖修饰 增强ADCC 活性的另外一条途径就是通过修饰改变Fc片段中的低聚糖结构。

1.2.1 GlcNAc分叉结构 GlcNAc的分叉结构即一个 β1，4-GlcNAc残基附着在一个核心β-甘露糖残基上，β1、4-Glc-NAc残基可以影响治疗性抗体的生物学活性，尤其是ADCC作用。一种抗成神经细胞瘤抗体IgG1和一种抗CD20抗体IgG1，每一种抗体都具有GlcNAc分叉结构，它们与那些没有GlcNAc分叉结构的IgG1抗体相比，其增强ADCC活性作用超过10倍。

1.2.2 岩藻糖缺失 在体外和体内评估中，岩藻糖缺失抗体与一般抗体相比，前者通过增强ADCC活性将提高抗体的抗肿瘤活性。岩藻糖缺失抗体在治疗B细胞淋巴瘤中，在CD20抗原密度很低的情况下仍然可诱发强大活性的ADCC，而含有岩藻糖的抗体却不能诱发。当人血清存在的情况下，血清IgG(浓度＞10 mg/ml)会与一般的治疗性抗体竞争性结合FcgRⅢa，使其所诱发的ADCC活性明显受到抑制，由于缺失岩藻糖抗体与FcgRⅢ受体的结合力增强，其所诱发的ADCC活性并没受到明显影响。

1.3 CH2片段或铰链区中氨基酸修饰 CDC是一种溶细胞级联反应，被认为是补体系统的经典途径，该途径由一系列大量存在于血清中的补体蛋白(C1～C9)介导。它由与细胞表面相连的抗体分子中的Fc段和C1q结合所诱发。在鼠模型中，利妥昔单抗也是通过一种补体依赖的机制杀伤肿瘤细胞。然而肿瘤细胞能够通过不同的生物抵抗机制躲避抗体的袭击。补体调节蛋白表达可抑制细胞表面的补体蛋白酶级联反应，明显降低利妥昔单抗抗滤泡型非霍其金淋巴瘤和Burkitt’s淋巴瘤细胞系的CDC活性，从而产生 CDC抵抗。具有更强CDC活性作用的新型抗体已经成功研发，这些突变体通过促进Fc片段与C1q的结合来增强CDC活性。CH2片段中氨基酸被修饰后的抗体在抗表达CD20的B细胞淋巴瘤中，其与C1q结合方面和诱发CDC活性方面都得到提高。或对铰链区中某些氨基酸进行修饰，带有被修饰恒定区域的抗体在抗高表达EphA2的胃癌细胞系方面，与普通型抗体相比，其所诱发的CDC抗瘤活性得到明显提高［4］。

1.4 重链恒定区域内IgG1和IgG3序列置换重组 另一种增强CDC活性的方式就是通过在一条重链恒定区域内置换IgG1和IgG3序列，进行人工改造重链［5］。在体外与野生型利妥昔单抗相比，在抗CD20阳性B细胞淋巴瘤细胞系中通过用带有IgG1/IgG3混合恒定区抗体诱发的CDC活性所增强的程度，超出了几十倍。此外，它所增强的细胞毒性作用同样被证实在短尾猴模型中。这种方法也许是最佳的，因为它可能不会产生非自身肽，而上面介绍的氨基酸修饰可能会产生非自身肽，它的另一个重要特征是保持了对FcγRIIIa的亲和力和ADCC活性，并且与亲代IgG1的水平一样［5］。

1.5 延长抗体的血清半衰期 在Fc片段内开发新的突变，使抗体具有更强的与新生Fc受体结合的能力，延长抗体的血清半衰期，增加抗体疗效。该受体广泛表达于多种内皮细胞，并通过IgG与FcRn结合维持IgG稳定。在鼠模型中，该突变体与鼠IgG相比，具有更强的FcRn结合力和更长的血清半衰期。在恒河猴体内，这种突变抗体血浆半衰期几乎是无突变IgG的2倍［6］。

2 免疫耦联物

随着对单抗药物的不断深入研究，单抗既可以直接治疗疾病，也可对单抗进行基因工程改造，把单抗中的Fc段与对肿瘤特异性较高的一些分子进行耦合形成新型的免疫交联物，如FVⅡ/Fc免疫交联物、EphA2抗体。其对肿瘤的杀伤作用包括ADCC、CDC、ADCP。或者与“弹头”药物耦联，用作“弹头”的物质主要有放射性核素、化学药物和生物毒素。

由于TF组织因子在多种肿瘤细胞及肿瘤内血管内皮细胞中表达，并且FVⅡ可以特异性结合 TF，Hu等［7］把FVⅡ基因与IgG1中Fc基因进行融合，并克隆到腺病毒中，将带有FVⅡ/Fc融合基因的腺病毒通过瘤内注射到前列腺癌荷瘤SCID鼠体内，让其在荷瘤鼠体内表达FVⅡ/Fc免疫交联物。实验结果证明该免疫交联物具有明显的杀伤和抑制前列腺癌移植瘤的作用。

ErbB2受体的过表达与胸腺癌的恶性进展和预后不良有关。曲妥单抗是目前唯一用于治疗胸腺癌的人源化抗ErbB2抗体，虽然已经被证明是有效的，但是还有相当一部分胸腺癌患者对曲妥单抗治疗表现出原发或继发的抗药性。Gelardi等［8］通过抗人ErbB2-scFv和人核糖核酸酶或人IgG1的Fc片段进行融合，获得两种新型基因工程抗体，在体外和体内试验中，这两种抗体靶向ErbB2阳性的癌细胞并诱发细胞毒性作用。它们与曲妥单抗所识别的ErbB2表位不同，并且也没有心脏不良反应。这两种新型抗体在体外和体内不仅对耐曲妥单抗肿瘤细胞有毒性作用，还由于它们可以识别曲妥单抗所不能识别的抗原表位，因此这两种抗体不会和曲妥单抗一样，会抑制ErbB2下游的信号通路。总之，这两种新型抗体同时能满足心脏功能异常的ErbB2阳性的癌症患者和对曲妥单抗产生耐药性的胸腺癌患者。

3 小分子抗体

小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达以及易于进行基因工程操作等优点而受到人们重视。目前研究较多或实用前景较明确的有以下几种:Fab段、Fv段、单链抗体、二硫键固定的 Fv段、Diabody、Minibody等。目前对于前列腺癌浸润超出可切除范围的部分仍没有根治性的疗法，由于前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一个很好的肿瘤靶点，如能结合肿瘤抗原和T细胞表面分子的双特异性单克隆抗体，有望提高T细胞的抗原特异性细胞毒性，从而为治疗前列腺癌提供新的治疗途径。Buhler等［9］把抗CD3基因和抗人PSMA单链Fv片段基因联接在一起构成双特异性抗体基因，并让其在大肠杆菌中表达出可以同时特异性结合人PSMA和T细胞抗原CD3的双特异性单克隆抗体，该抗体可以最大程度地抑制PSMA阳性前列腺癌细胞生长。进一步研究证明，虽然双特异性单抗可以结合所有T细胞，但只有那些与癌细胞上PSMA分子相结合的双特异性单抗通过PSMA的二聚结构聚集成簇才具有激发T细胞的活性［10］。

4 展望

目前，在某些血液和实体恶性肿瘤免疫治疗方面，抗体抗肿瘤治疗已取得巨大的成就。与许多小分子抗癌药不同，抗体的抗肿瘤作用归功于其靶向特异性、更长的血浆半衰期和一些免疫系统杀伤作用，加强受动器功能和靶向特异性是提高其疗效的有效途径。总之，肿瘤基因工程抗体治疗方式多样，如能灵活应用，扬长避短，不断改进，在抗癌领域内将有所作为。

［1］Golay J，Cortiana C，Manganini M，et al.The sensitivity of acute lymphoblastic leukemia cells carrying the t(12;21)translocation to campath-1H-mediated cell lysis［J］.Haematologica，2006，91(3):322-330.

［2］Stavenhagen JB，Gorlatov S，Tuaillon N，et al.Enhancing the potency of therapeutic monoclonal antibodies via Fc optimization［J］.Adv Enzyme Regul，2008，48(1):152-164.

［3］Bruckheimer EM，Fazenbaker CA，Gallagher S，et al.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity effector-enhanced EphA2 agonist monoclonal antibody demonstrates potent activity against human tumors［J］.Neoplasia，2009，11(6):509-517.

［4］Dall’Acqua WF，Cook KE，Damschroder MM，et al.Modulation of the effector functions of a human IgG1 through engineering of its hinge region［J］.J Immunol，2006，177(2):1129-1138.

［5］Natsume A，In M，Takamura H，et al.Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities［J］.Cancer Res，2008，68(10):3863-3872.

［6］Dall’Acqua WF，Kiener PA，Wu H，et al.Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor(FcRn)［J］.J Biol Chem，2006，281(33):23514-23524.

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［8］Gelardi T，Damiano V，Rosa R，et al.Two novel human anti-ErbB2 immunoagents are active on trastuzumab-resistant tumours［J］.Br J Cancer，2010，102(3):513-519.

［9］Buhler P，Wolf P，Gierschner D，et al.A bispecific diabody directed against prostate-specific membrane antigen and CD3 induces T-cell mediated lysis of prostate cancer cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2008，57(1):43-52.

［10］Buhler P，Molnar E，Dopfer EP，et al.Target-dependent T-cell activation by coligation with a PSMA x CD3 diabody induces lysis of prostate cancer cells［J］.J Immunother，2009，32(6):565-573.