大鼠胚胎冷冻保存技术及研究进展

张 丽,谭竹钧,刘 牧

(1.广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006；2.中国医学科学院 医学实验动物研究所，北京 100021)

大鼠是常用实验动物之一，在生命科学和医学研究领域中均有较高应用价值。随着大鼠基因序列测序的完成和基因敲除技术的发展，通过转基因、基因敲除等生物工程技术已成功建立的人类大鼠疾病模型日渐增多，如高血压大鼠、心脏病大鼠、糖尿病大鼠等。以常规的繁殖方式维持这些大鼠品系，不但需要大量的饲养空间和维持经费，还可能随时发生遗传变异、漂移和遗传污染[1]。通过冷冻保存大鼠胚胎的方法建立冷冻胚胎库，不仅可以防止由各种原因造成有价值的品系和稀有突变体品系的丢失；预防群体内的遗传变异，漂移和遗传污染；防止疾病的传播等。此外，冷冻胚胎保种，还便于运输和进行地区间和国际间的交流。

大鼠胚胎冷冻技术最早由Whi t tingham等[2]建立，首次利用二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，通过慢速冷冻对大鼠胚胎冷冻获得成功。此后,相关学者对大鼠胚胎冷冻保存进行了大量的研究, 取得了一定的研究成果。由最早的人工控制缓慢冷冻，到利用电子计算机控制的胚胎冷冻装置进行简便、快速的程序化冷冻，以及玻璃化冷冻。本文综述了大鼠胚胎冷冻保存技术的研究进展。

1 冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞在低温或超低温时产生损害(物理性、化学性)等的一类化合物。其作用机理为：冷冻保护剂可以与溶液中水分子结合或相互作用，从而降低冰点，减少冰晶形成，降低胚胎细胞外冰晶对细胞产生的损伤[3]。冷冻保护剂常与适宜的培养液配制成一定浓度的溶液，作为冷冻保护液。冷冻保护剂的分类：

1.1 低分子量渗透性冷冻保护剂

低分子量渗透性冷冻保护剂主要包括甘油(Gl ycer in)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙烯二醇(PG)、乙酰胺(Acetamide)、甲醇(Methanol)等。此类冷冻保护剂分子量小, 能渗透到细胞内，在细胞内外产生一定浓度差，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过分脱水皱缩。但它们对胚胎也有一定毒害作用，尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。选择该类物质作为冷冻保护剂需优先考虑其细胞毒性，渗透性次之。此类保护剂在玻璃化冷冻中得到广泛的应用。如乙二醇,形成玻璃化能力弱，但其毒性低、渗透性好，与形成玻璃化能力强的冷冻保护剂(DMSO等)组合，可组合成多种效果较好的玻璃化冷冻液。另外，冷冻剂对胚胎的渗透性及毒害作用不仅取决于冷冻剂本身的性质，还与胚胎所属动物种属及发育阶段有关[4]。

1.2 低分子量非渗透性冷冻保护剂

低分子量非渗透性冷冻保护剂指某些糖类,例如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)和一些二糖(蔗糖、海藻糖)，多糖(棉子糖)。目前应用最广泛的是蔗糖。冷冻液中添加的糖类有两大特性，一是既能提高渗透压来促进细胞脱水，保持细胞结构的完整。在糖溶液中预平衡能够使细胞脱出更多水分，减少胚胎与毒性大的渗透性冷冻保护剂接触时间；二是减小达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的浓度。这两个方面均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。另外，糖类还可作为渗透压缓冲物质，通过减少解冻时细胞的膨胀速率和程度减少渗透性损伤的发生。这类冷冻保护剂在低温下对胚胎无毒害作用，但是温度升高时却对细胞有毒害作用[5]。多糖和二糖在室温下不易溶解并且容易从溶液中析出，同时二糖需要较高浓度才能形成玻璃化状态。

1.3 大分子物质

大分子冷冻保护剂主要有聚乙二醇(PG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚蔗糖(Ficol l)、羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch)、透明质酸钠(Soduim Hyaluronate)、葡聚糖(Glucan)等聚合物。这类冷冻保护剂比渗透性冷冻保护剂毒性低，且有促进玻璃化作用, 能部分替代其他非渗透性冷冻保护剂，降低冷冻液的毒性。胚胎解冻时比冷冻时更易形成使细胞致死的冰晶，因此克服解冻时所形成的致死冰晶至关重要。据报道，许多大分子物质如聚乙二醇、聚蔗糖、透明质酸等都具有阻止解冻时形成冰晶的作用。目前该类冷冻保护剂的保护机制尚不完全清楚。史洪才[6]推测，大分子保护剂可以优先结合溶液中的水分子，从而降低溶液中自由水含量，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻冷冻中溶质对细胞产生的损伤；复温时使细胞外液的渗透压变化较为稳定等。

2 常用冷冻方法及比较

2.1 常规慢速冷冻

常规慢速冷冻由Whi t t ingham等[7]首先发明，对小鼠胚胎冷冻保存获得成功，解冻后移植产下后代。随后，牛(Wilmut 和 Rowson，1973)、家兔(Whittingham 和 Adan-ls，1976)、大鼠(Whittingham，1975)、山羊(Bihon 等，1976)和绵羊(Wdhdsen 等，1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功。将胚胎依次放入一系列逐渐增加冷冻保护剂(如DMS0、丙三醇和乙二醇)浓度的溶液中梯度脱水，再利用程序冷冻仪或不同温差的冰箱分阶段降温。Wi l ladsen[8]在此基础上做了改进, 在降温达到-35℃～-38℃后直接投入液氮中保存，将冷冻时间缩短到2 h之内。目前常规慢速冷冻在冷冻保护剂的选择、添加方式、平衡时间、植冰温度及降温速率等环节已形成了一整套完整的技术流程，且被广泛应用于畜牧业生产中，为大鼠胚胎冷冻的研究提供了可行的模式。

大鼠胚胎常规慢速冷冻的具体操作步骤如下：①室温下将胚胎置于冷冻液中，5～10min,使胚胎和冷冻液间达到平衡; ②在 -5℃～-9℃进行人工植冰; ③以0.3℃～0.6℃/min的速率缓慢降温; ④降温到-30℃～-40℃，投入到-196℃的液氮中保存。

常规慢速冷冻法采用低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒害小，解冻后胚胎的存活率和移植成活率都较高；在储存和运输时，对于环境温度的变化有更大的耐受力。但操作过程繁琐，费时较长，需要人工植冰，又需要程序冷冻仪，实验成本较高。

2.2 玻璃化冷冻

自1985年Ral l y等[9]用玻璃化溶液冷冻小鼠8-细胞胚胎获得成功以来，经Schefen等[10]、Nakagata[11]、Kasai等[12]、Zhu等[13,14]、Szélld等[15]、Vincent等[16]、Saha[17]以及 Dobinsky等[18]研究者的不断改进，玻璃化冷冻技术日趋成熟，并广泛用于马、兔、牛、山羊、猪等家畜不同阶段胚胎的冷冻保存[19,20]。

这种方法采用快速降温和高浓度的冷冻保护剂，使冷冻过程中溶液变得十分黏稠和坚固，不形成冰晶。快速降温可以使玻璃化溶液中冷冻保护剂的浓度降低，降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。为提高冷冻速率，研究人员发明了许多非常有创意的冷冻载体，其中最受欢迎的是由Vaj ta发明的OPS法[21]。OPS法是利用加热将细管拉长拉细，使管壁变薄、细管颈部体积变小来提高冷冻速率，其冷冻速率可达20 000℃/min以上。采用该法冷冻胚胎可以防止冷冻损伤、降低冷冻保护剂对胚胎产生的毒性和渗透性损伤。但高浓度的冷冻保护剂会对胚胎产生毒害作用。因此寻找毒性低、形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎玻璃化冷冻研究的关键和热点之一，也是大鼠胚胎冷冻的研究热点。有关研究表明，把不同种类的冷冻保护剂组合成玻璃化冷冻液，能达到降低冷冻保护剂对胚胎毒害作用，提高玻璃化冷冻效果的目的。

玻璃化冷冻操作简单，整个冷冻过程仅持续不过一两分钟，且不需要昂贵的仪器设备，有利于野外操作及大规模推广应用。不利的因素主要是对实验室工作人员的熟练操作程度要求极高。玻璃化冷冻的全部操作必须在规定的数分钟或更短的时间内完成，否则高浓度的冷冻保护液会对胚胎造成一定的毒害作用，甚至致胚胎死亡。寻求对胚胎低毒或无毒的化合物，是玻璃化冷冻方法急需解决的问题。近年来对玻璃化胚胎冷冻研究趋向于在冷冻保护剂中添加其他物质，如糖类、抗冻蛋白、透明质酸、松弛素、盐等，以提高冷冻效果和冷冻成功率[22]。

3 解冻方法

解冻方法对胚胎的存活和能否进一步发育有很大的影响。实验证明，冷冻胚胎的快速解冻优于缓慢解冻。采用快速解冻，胚胎在0～40 s内由-196℃迅速上升至30～35℃, 瞬间通过危险温区，使冰晶来不及形成。为了避免冷冻保护剂对胚胎产生毒害作用，解冻后需立即除去冷冻保护剂，通常用蔗糖溶液一步法或阶梯法，分步将冷冻保护剂脱出。目前，蔗糖的浓度还没有一致的共识，但常用0.25～0.5mol/mL的蔗糖作为梯度解冻液。

大鼠冷冻胚胎的解冻步骤：①胚胎冷冻管自液氮中取出后在室温下的空气内(20～28℃)停留10～15 s；②将含胚胎的冷冻管投入37℃，水浴10～30 s，轻轻摇动；③冷冻管内加入1mL预热至37℃的0.25mol/mL蔗糖溶液，移入35mm或60mm培养皿中，立视显微镜下检出形态良好的胚胎(或用含0.25mol/mL，0.5mol/mL蔗糖的PBS缓冲液分两步)脱除冷冻保护剂并使胚胎复水；④移入培养液(大鼠体外受精液)观察其复苏发育情况；或在二氧化碳培养箱内，应用R2ECM大鼠早期胚胎发育培养液继续培养；或准备移植。

4 研究现状及应用前景

4.1 研究现状

大鼠胚胎冷冻-解冻后的复苏率和移植率是大鼠胚胎冷冻技术面临的最主要问题。为此相关科学家针对低温保护剂、冷冻方法、解冻方法等各方面开展了一系列的研究，并取得了一定的成果。

1975年Whit tingham等[2]首次利用二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，通过慢速冷冻对大鼠胚胎冷冻获得成功。采用1.5mol/L、3mol/L的DMSO作为冷冻剂，对大鼠的2-细胞、4-细胞、8-细胞期胚胎进行冷冻，冷冻和解冻步骤与其在1972年成功冷冻小鼠8-细胞期胚胎相似，解冻后胚胎正常率也与小鼠相近。不同的是，解冻后不同阶段的大鼠胚胎在进行体外培养时差异却很大。例如：经冷冻-解冻后61%的8-细胞，培养48 h后能发育至囊胚；但仅有30%的2-细胞可发育至4-细胞。大鼠体外培养的胚胎在4-细胞期后产生发育阻滞，而不像小鼠那样在体外培养时会产生2-细胞期发育阻滞。这一现象与Folstad[23]，Mayer[24]、Toyoda[25]等对大鼠2～8-细胞期的新鲜胚胎进行体外培养的结果相一致。冷冻-解冻后正常胚胎对代孕鼠进行移植，2-细胞期冷冻胚胎移植后约可获得11%的新生仔鼠。

冷冻保护剂的改良使得复苏后大鼠胚胎的发育能力大大提高。如1977年Miyamoto[26]等用乙二醇作为主要的冷冻剂，对大鼠2～8-细胞期胚胎进行冷冻，复苏后64%的胚胎可发育至桑葚胚。1982年Kasai[27]等用甘油作为主要的冷冻剂，解冻后71%的胚胎能发育至桑葚胚。随后大量的研究亦证明，在大鼠的胚胎冷冻中，以甘油作为冷冻剂的效果比乙二醇好。

1988年T Kono等[28]首次采用玻璃化冷冻法对大鼠囊胚进行冷冻获得成功。以二甲基亚砜、乙酰胺、丙二醇及乙二醇组合液作为冷冻保护剂，胚胎在室温下冷冻液预平衡后直接投入液氮中保存。解冻后79%(117/149)的胚胎形态正常，100% (48/48)的胚胎在体外培养能发育至扩张或孵出囊胚；假孕鼠移植获得41%(28/69)的新生仔鼠。随着玻璃化冷冻方法在马、兔、牛、山羊、猪等家畜不同阶段胚胎的冷冻保存中的广泛应用，玻璃化冷冻方法在大鼠胚胎冷冻中的研究亦渐成热点。

近10年来，国内外学者在大鼠胚胎冷冻技术上做了大量研究并取得了很大的进步。国内研究：如梁成光等[29]对大鼠囊胚进行常规慢速冷冻、玻璃化冷冻、OPS冷冻-解冻，用Whi t ten培养液在37.5℃、100%湿度和5%C02条件下进行发育培养，24 h后胚胎解冻存活率分别为82.4%、76.9%和85.7%；48 h后孵化率分别为47.1%、46.1%和53.6%。但是3种方法的存活率及孵化率均无显著差异。徐平等[30]对5日龄大鼠胚胎进行了玻璃化冷冻方法和缓慢冷冻方法的比较研究，胚胎复苏率分别为60.46%和64.29%。移植后受孕率分别为39.47%和42.56%。两种方法的复活率和受孕率亦无显著差异。2008年周生来等[31]选用1mol/L的DMSO和DAP213冷冻剂对大鼠2-细胞期胚胎进行两步玻璃化冻存，平均复苏率达85%～88.3%，产仔率达37.14%。

国外研究：如2003年Han等[32]选用EFS20和EFS40玻璃化冷冻液，利用两步法对大鼠各阶段(1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞等)胚胎进行冻存，复苏率达到94%～100%，获得了很好的冻存效果。2003年Isachenko等[33]对大鼠早期桑葚胚、早期囊胚、囊胚及扩张囊胚进行两步法玻璃化冷冻，其复苏率分别为81%、83%、34%和76%。研究发现该方法不适合囊胚期冷冻，适用于冷冻其它三个阶段的胚胎。2009年 Sei ta等[34]采用玻璃化冷冻法对大鼠原核期胚胎进行冷冻获得成功。室温下，胚胎于冷冻液1(7.5%EG+7.5% DMSO+20% FCS)和冷冻液2(15% EG+15%DMSO+0.5mol/L Sucrose+20% FCS)中预平衡后直接投入液氮中进行保存。复苏后胚胎获得较高的存活率：82%～96.1%的胚胎能发育到2-细胞，36.5%～40.3%能发育至囊胚。

4.2 应用前景

在冷冻保护剂的研究中，一些生物活性物质渐成研究的热点。这类用于冷冻保护的生物活性物质主要包括牛血清白蛋白(BSA)、抗冻蛋白(AFPs)和热滞蛋白(THPs)等。血清是冷冻基础液的成分之一, 能够稳定胚胎细胞膜、阻止胚胎或卵母细胞透明带在冷冻过程中硬化。抗冻蛋白(AFPs)是一类能在低温条件下生存的生物体内发现的蛋白质，其不仅可非依数性地降低溶液冰点，对冷冻细胞和胚胎起高效的保护作用，还能与细胞膜作用，封闭离子通道，阻止溶质渗透，保护细胞膜的完整性。AFP和THP可与细胞膜相互作用，改善细胞膜的稳定性，在低温下保护胚胎不受损伤[29]。热滞蛋白(THPs)在高浓度下对细胞无毒性作用，其分子量大，不影响细胞的渗透压，同时还可以溶解在缓冲液或玻璃化液中[35]。

AFPs自发现以来引起了许多学者的兴趣，其结构和抗冻机理的研究更是被关注的热点。近年来，越来越多的越冬昆虫和植物被认为以生产抗冻蛋白作为其对低温适应的策略。若抗冻蛋白能在大鼠胚胎冷冻技术中成功应用，则可能使胚胎冷冻保存上一个新台阶。

大鼠胚胎冷冻保存技术的研究虽取得了一定进展,但仍存在许多不足之处。如对冷冻保存的机理尚不完全清楚。尤其是在冷冻过程中对细胞超微结构(如膜结构、细胞骨架等)的损伤机理方面研究甚少；胚胎在体外培养的发育率和体内移植后的产仔率较低(37%～43%)[25,27]；冷冻保存过程中的技术环节仍有待于规范化和简单化。为此,广大科研工作者要在现有方法的基础上，进一步探讨冷冻保存过程中细胞损伤的机理；提高冷冻-复苏率等低温生物学领域遗留的难题。

感谢：中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授对本课题从经费和技术指导各方面给予的大量、慷慨的帮助，特此表示衷心感谢！

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