犬精液冷冻保存稀释液的研究进展

吴 衍,熊 前

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌 330100)

犬精液冷冻保存技术在犬种资源的保护、品种选育和加快育种进程等方面具有重要的作用。1780年，意大利生理学家Spmlanzani首次用犬进行人工授精(AI)试验并取得成功。1959年，Seager首次报道了犬的冻精人工授精试验成功。1965年Har rop和Bendor f等人以牛奶和卵黄-柠檬酸缓冲液稀释犬精液，在5℃条件下精子存活了数天。1988年，Bat tista等比较了Tris稀释液、Test稀释液、乳糖稀释液和Pipes稀释液。从结果来看，无论存活率还是活力和存活时间Tris稀释液都最好。之后，人们相继建立了有关精液冷冻、品质鉴定以及AI的一系列优化参数。世界上一些发达国家的犬冷冻精液与AI研究研究起步早，目前已得到了广泛应用。美国养犬俱乐部(AKC)早在20世纪70年代即投入了大量的资金用于犬的冷冻精液和AI研究，并详细制定了冷冻精液生产以及AI各主要环节的操作规程；同时规定，从1981年起，只有经过AKC审验合格的配种站才能提供犬的冷冻精液。

我国在这方面的研究起步较晚，目前尚处于试验研究阶段。1985年，潘寿文等对德国牧羊犬的冻精及人工授精进行研究，输精9头母犬，2头怀孕，平均窝产仔2头；1991年，王力波等对德国牧羊犬的冻精也获成功，输精5头，4头怀孕，平均窝产仔7头；1994年，刘海军等对德国牧羊犬冻精进行研究，结论为在最优条件下，解冻后精子活力为0.47，复苏率52.2%，存活时间8.23 h，存活指数1.08，顶体完整率43%。

从国内外研究者的结果来看，犬精子冷冻保存的效果不是很好，冻后活力一般在0.4左右，用冻精人工授精后受孕率低，产仔数少，给犬人工授精技术的推广带来很大的困难。为了提高冷冻精液的品质和受胎率，许多研究者就稀释液中的添加物进行了大量研究，不同程度影响到冷冻精液的品质和受胎率。早期经典的犬科动物冻精稀释基液有多种，例如脱脂奶乳、Tris等，目前最普遍使用的一种稀释液是添加适量果糖或者葡萄糖以及20%体积蛋黄的Tris-柠檬酸缓冲液。近年来，人们也常用经济、方便的椰子汁来替代传统的稀释液进行精液冷冻试验。各种商品化的稀释液也陆续在市场上出现并得到人们的认可，如德国Tiefenbach基于Tr is的Tri ladyl，美国Pennsylvania的C.L.O.N.E.。

1 犬冷冻精液稀释液的pH值

由于精子代谢很强烈，能量消耗快，同时因代谢产物积累，改变了精子环境的pH值，导致某些酶的活性被抑制，致使精子丧失受精能力。因此，稀释液pH值一定要控制在一定范围。国内外学者已对此作了大量研究，精液pH值可因精子代谢及其他原因而变化，当精液pH值降低时，精子代谢与活动减弱；反之，因pH值上升，精子代谢与活动增强，能量迅速耗竭，存活时间减少。为维持正常代谢活动，精子需要适宜的pH值范围，犬精子适宜的pH值范围是6.4～7.0。部分国外学者认为最佳pH是6.6，国内部分学者在配制精液稀释液时对pH值未加调整，这是造成了精子冻后活力降低的重要因素。辛国省等通过对藏獒精液低温保存稀释液的pH值研究认为,犬的精液低温保存稀释液的最适pH为6.5。

2 质膜保护剂

卵黄在低温保存精液的冷却过程中是一类很好的防精子冷休克的物质,可以使精子质膜在冷冻过程中损坏的磷脂得以修复。同时，卵黄还是一种渗透性缓冲剂, 使精子能耐受低渗和高渗胁迫。所以，稀释液中经常添加蛋黄来作为精子质膜的保护剂，其浓度随缓冲液中其它组成成分不同而不同。但是蛋黄的应用可以引起病原体的广泛传播。随着犬冷冻精液进入国际市场，人们也在寻找卵黄的替代品。抗氧化剂二叔丁对甲酚(BHT)类物质在牛的精子冷冻中对精子质膜具有很好的保护性,但在犬科动物中尚需进一步研究。

3 冷冻保护剂

保存过程中，精子经历了降温、冻结、解冻过程，其中冰晶形成不可避免地损伤了精子(李青旺等，2003)。由于冰晶会导致类脂蛋白变性，破坏细胞膜相结构、产生机械损伤，导致精子超微结构破坏、顶体物质流失、顶体膜脱落等(Oehninger等，2000)。因此，有效降低大冰晶形成方法就是使用冷冻保护剂。理想的冷冻保护剂应该具有3方面的特征，即可以快速渗入精子细胞内，对温度依赖性低，对精子毒性小。常用的冷冻保护剂有甘油、乙二醇、DMSO等。其中甘油应用最早，其有利于电解质和水结合，使精子内含水蛋白稳定,减少冷冻时细胞内冰晶的形成，降低对精子的损伤。保护剂有毒性作用，引起精子超微结构的明显损害。随着保护剂浓度的升高，其对精子的毒性作用亦随之增强，冷冻精子复苏率会呈下降趋势。乙二醇与甘油相比不仅具有相似的化学结构，而且分子量较小，所以具有更高的渗透性，在人、小鼠等的精子冷冻试验中乙二醇都有比甘油更好的保护效果。但在犬科动物中，其效果有很大的差异。Cavalcanti等的试验表明，相对于甘油，在含有相同浓度乙二醇的稀释液中，解冻后的精子活率偏低；Soares等发现，0.25、0.50mol/L的乙二醇与0.80mol/L的精子活率的影响没有显著差异，但是精子在含1.0mol/L的乙二醇的稀释液中解冻后的活率相对于前者有很大程度的降低；张志平等对甘油和乙二醇浓度进行了比较研究，结果发现，4%甘油对犬精子冷冻效果较好，而且优于用5%乙二醇。Mar tins等(2006)也报道相似结论。最近，Rota等用低渗膨胀法分别测定了5%浓度的乙二醇和甘油对精子解冻后的活力和质膜完整性，结果显示乙二醇可以使解冻后短期内(1～3 h)的精子具有极高的活率和很完整的质膜。

在冷冻稀释液里加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)也可以提高犬解冻精子的活率和存活时间。目前商品化的SDS类冷冻稀释液最常用的有Equex STM Paste和Orvus ES Paste两种，并且对提高解冻后精子的活率都有很好的效果。Equex Paste也偶尔见于文献，但普遍没有发现明显提高精液品质的作用。Pena等推测SDS对解冻后精子的作用可能与细胞内Ca2+浓度有关。

4 低温保存犬精液稀释液的能量物质

糖类物质不仅可以作为保护剂保持稀释液的渗透压，而且可以在冷冻过程中为犬精子提供代谢所需要的能量。果糖和葡萄糖是目前最常用的两种糖，但是，文献中这两种糖在稀释液中的浓度从5mmol/L到120mmol/L不等。Ponglowhapan等的研究结果显示，在卵黄一Tr is稀释液中，70mmol/L的果糖对精子的冷冻储藏效果最好，但是相对于果糖，犬精子更倾向于消耗同浓度条件下的葡萄糖。

5 其他

Michael等研究了添加抗氧化剂对解冻后精子活率的影响,结果表明在稀释液中分别添加维生素C(1.5mmol/L)、乙酰半胱氨酸(1.5mmol/L)、牛磺酸(0.6mmol/L)、过氧化氢酶(300 U/mL)等可以不同程度地增强解冻后精子的活率，但是最佳浓度还需进一步优化。

精液和稀释液都是营养丰富的物质，是细菌微生物孳生的适宜环境。有研究表明，未发现细菌的精液其保存效果非常好，在有细菌的精液，其保存性因细菌的种类和数量不同而异，并且指出大肠杆菌等对精液保存影响极大，可在短时间内使精子活力、顶体完整率大幅度下降，青霉素、链霉素等抗菌物质能抑制细菌的孳生。