巯基转移酶与晶状体氧化还原调控

廖 萱，兰长骏

(川北医学院附属医院眼科，四川 南充 637000)

白内障的发生是一个复杂的过程，大量的实验和临床研究提示氧化应激与白内障有密切关系。氧化还原系统失衡导致细胞内氧自由基生成增加和细胞膜功能障碍，引起晶状体纤维蛋白的结构和构象改变，导致晶状体混浊。研究显示:在各种氧化应激损伤过程中，细胞内氧化还原调节的关键是蛋白质巯基(-SH)被氧化形成二硫键(-S-S-)，导致蛋白二硫化物的形成。目前已知的细胞内负责二硫化物还原的系统主要是巯基-二硫键还原酶家族，巯基转移酶(thioltransferase，TTase)是这个家族的重要组分［1］。近年来对TTase系统的研究日益受到重视，对细胞氧化还原机制的认识也进一步加深。研究表明，TTase对还原蛋白二硫化物的二硫键具有高度的特异性，是机体中催化蛋白二硫化物还原唯一的酶［2］。TTase可在其活性位点和对应二硫化物的半胱氨酸残基完成可逆的巯基-二硫键交换反应，调节蛋白质巯基或二硫键发生氧化还原所致的蛋白分子构型改变，从而阻抗蛋白质的氧化应激损伤或恢复受损蛋白质的生物活性［3］。TTase通过细胞内氧化还原的调节，在体内氧化防御体系中发挥着重要作用，并由此衍生出诸多细胞内外功能。

1 概况

1.1 分布:巯基转移酶又称为谷氧还蛋白，广泛存在于原核、真核生物中，一般含有100个左右氨基酸残基，由Askelof等［4］1974年在大鼠肝组织首次发现，并指出此酶催化巯基-二硫键交换。1976年Holmgren等［5］在缺失 Trx基因的大肠杆菌中发现TTase利用辅酶Ⅱ(NADPH)传递的电子还原靶蛋白中的二硫键，参与DNA合成。目前学者们已在大部分的生物体中发现TTase，并得到深入广泛的研究。

对于眼组织中 TTase的研究由 Raghavachari［6］等首次报导，指出TTase主要集中于晶状体，分子量为11.5kDa，在大鼠、猪、牛、豚鼠、鸡胚胎和人类的晶状体中功能和结构相似;TTase在晶状体上皮细胞中分布均匀且含量较皮质和核更高，其活性有赖于谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)和 NADPH，在 30℃、PH 7.4的磷酸盐缓冲液中表现出最大活性。随后在1997年克隆了来源于人晶状体的 TTase cDNA［7］。Wu［8］证实在大多数眼组织中发现TTase，其在眼组织的分布主要集中在眼前节，在晶状体上皮细胞中的活性远大于晶状体皮质和核，玻璃体中没有检测到具有活性的TTase。人晶状体TTase可以高效还原蛋白二硫化物混合物和具有脱氢抗坏血酸还原酶活性，其结构和功能特性与猪肝脏和人胎盘TTase完全相同［9］。

1.2 结构和分类:TTase蛋白具有3个活性区域，即暴露于蛋白表面的巯基-二硫键活性位点CXXC或CXXS，还原型谷胱甘肽(GSH)结合位点，和疏水性表面区域。TTase通常以氧化态或者还原态存在。典型的TTase有两个半胱氨酸残基(-Cys)，氧化态时两个半胱氨酸残基的巯基以分子内部二硫键的形式连接，还原态时C端和N端半胱氨酸残基的巯基形成邻位双巯基活性中心，提供参与蛋白质巯基-二硫键转换的侧链基团-SH;附近的GSH结合位点用以结合还原型GSH并共同作用于蛋白质二硫键。

在不同生物体中有多种不同结构和催化功能的TTase异构体。根据结构和催化特点可以大致分为四类:第一类具有典型的二巯基活性位点序列CXXC和标准的折叠结构，是核糖核苷酸还原酶的电子供体，分子量约为10kDa。第二类具有二巯基活性位点序列CPYC(Cys22-Pro-Tyr-Cys25)，主要由含有活性位点的折叠区和α螺旋构成，具有TTase的氧化还原酶活性。第三类具有单巯基活性位点序列CXXS，对其底物有相当的特异性。第四类植物CC型，较其它物种的TTase研究少。人类的TTase有两种同工酶，分别定位于5q14和1q31.3。

1.3 生理功能:TTase是巯基－二硫键氧化还原酶家族的重要组成部分，在体内通过广泛的途径进行氧化还原调节，提供细胞质内的还原环境，抵抗氧化应激损伤［10］。TTase可恢复细胞内一些含有半胱氨酸残基的抗氧化蛋白和转录因子的活性，从而阻抗和治疗活性氧导致的细胞氧化应激损伤［11］。William A［12］等研究发现，大肠杆菌中还原型谷胱甘肽(GSH)多于氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH∶GSSG比例达50－200∶1，推测大肠杆菌内TTase利用还原型GSH对维持巯基基团的还原状态起了一定的作用。在正常情况下，动脉平滑肌细胞内TTase也有所表达，说明TTase在正常情况下维持细胞内还原环境的重要作用。TTase的抗氧化作用还表现在细胞受到氧化应激后其基因表达增加，通过表达上调来抵抗氧化应激、保护细胞免受氧化损伤。Raghavachari［13］等报导在氧化应激条件下，人晶状体上皮细胞TTase表达上调，参与晶状体上皮细胞氧化还原状态的维持。Lofgren［14］发现敲除 TTase的小鼠晶状体上皮细胞(TTase□/□)抗氧化应激能力低于野生型(TTase+/+)，这些细胞更难存活和更多凋亡，移除H2O2的能力减弱。将纯化TTase重新加载到TTase□/□细胞，细胞抗氧化功能修复至接近正常状态。

TTase也是一种具有多种生物学功能的多效性细胞因子，参与生命活动的许多环节。通过其半胱氨酸残基上巯基和二硫键的可逆转换，可以改变某些功能性蛋白分子的构型，调控蛋白分子的活性、稳定性与正确折叠等，在信号转导通路中起着重要作用。TTase能与细胞凋亡的信号调控激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)结合并抑制其活性;葡萄糖诱导的氧化应激代谢能激活ASK1-MEKMAPK信号转导通路和使TTase从ASK1上分离;通过Ras-PI3K-Akt-NFκB途径，使NF-κB的DNA结合能力加强，抑制神经递质多巴胺(DA)对细胞氧化应激损伤所介导的凋亡。TTase还对转录因子AP-1、NF-1、Atf1和Pap1进行复杂调控。

2 抗氧化作用机制

机体组织或细胞受到氧化应激损伤后，脆弱的蛋白质巯基与非蛋白巯基配对形成二硫键-S-S-，形成蛋白质-S-S-谷胱甘肽(Pr-S-S-G)，或蛋白质-S-S-半胱氨酸(Pr-S-S-C)和蛋白质-S-S-γ-谷氨酰半胱氨酸等形式的蛋白质巯基二硫化物混合物。TTase利用谷胱甘肽作为辅酶，催化二硫化物的二硫键还原为巯基，恢复蛋白质结构和功能，从而对抗和修复活性氧所导致的氧化应激损伤，维持体内稳定的氧化还原状态。具有谷胱甘肽化作用的蛋白还包括蛋白分子伴侣、细胞骨架蛋白、细胞周期调节子等。

2.1 单巯基机制:催化还原蛋白与小分子形成的混合二硫键，如蛋白谷胱甘肽二硫化物(Pr-S-S-G)时，TTase仅利用N端半胱氨酸的巯基［15］，即两个还原状态半胱氨酸的巯基中只需其中一个起作用，这一机制称为单巯基机制。研究证明，单个的半胱氨酸即可提供还原Pr-S-S-G的二硫键活性。由于TTase对谷胱甘肽具有亲和力，TTase并不作用于Pr-S-S-G的蛋白底物本身，而是与其谷胱甘肽部分-S-S-G特异地相互作用，形成中间物TTase-S-S-G，并释放还原态目标蛋白 Pr-SH。TTase-S-S-G再被第二个GSH分子还原成为谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，谷胧甘肽还原酶(GR)利用磷酸戊糖途径提供的NADPH为供氢体，将GSSG还原为GSH。

2.2 二巯基机制:除单巯基还原机制外，TTase催化氧化还原机制还包括二巯基还原机制。二巯基机制是对蛋白质内二硫键的还原，催化还原通常发生在TTase上的两端半胱氨酸上，且TTase两个还原状态的半胱氨酸的巯基都是必需的。N端半胱氨酸暴露成为TTase活性位点攻击蛋白分子内二硫键，在TTase和蛋白底物之间形成混合二硫化物。然后另一活性位点C端半胱氨酸去质化，攻击N端形成分子内二硫键;同时蛋白底物与TTase形成的混合二硫化物的-S-S-被还原，从而产生还原态目标蛋白Pr-(SH)2，以及氧化态 TTase-S2。

3 TTase与晶状体的氧化还原

晶状体存在多重抗氧化屏障维持着氧化还原状态的平衡。在正常晶状体中，绝大部分蛋白质巯基处于还原态，以稳定晶状体纤维蛋白的结构和排列，而晶状体纤维蛋白的结构和排列关系决定了晶状体的透明性。由于晶状体蛋白含较多对氧化作用敏感半胱氨酸和巯基，易于形成二硫键;在氧化应激下，半胱氨酸的巯基被氧化成可逆再生的分子内/间二硫键形式，晶状体蛋白以二硫键相互连接形成聚合体，聚合体之间再以非共价键相连，从而产生巨大分子的高分子量蛋白(HM)，并组成水不溶性蛋白，光散射增加，蛋白结构改变，内在修复酶系统功能被破坏，晶状体发生混浊。

研究表明，TTase对维持晶状体巯基-二硫键氧化还原内环境的稳定至关重要，可能在保护晶状体免受氧化应激损伤方面发挥着重要作用。Raghabachari［13］等将人晶状体上皮细胞(HLEB3)暴露于0.1mmol H2O2，观察到TTase的活性与H2O2呈时间依赖关系，5分钟时TTase mRNA的表达开始增加，10分钟后达最高水平，60分钟恢复至正常水平。兔晶状体上皮系(N/N 1003A)较之人晶状体上皮细胞(HLEB3)的抗氧化活性更强，对H2O2的耐受剂量差异达5倍［16］。但长时间暴露于更高浓度的H2O2下会导致TTase下调。Wang［17］等将猪晶状体暴露在不同浓度(0.1mmol-10mmol)H2O2下培养，发现24小时后浓度0.1 mmol H2O2组活性下降了12%，1.5 mmolH2O2组活性下降了45%，10 mmol H2O2组几乎不能检测到 TTase，证实 TTase的活性与H2O2呈浓度依赖关系。Moon［18］等研究发现，在氧化应激下培养的猪晶状体的晶状体上皮细胞层TTase活性、蛋白表达以及mRNA转录增加，轻度H2O2刺激下TTase活性呈现缓慢的增加，强H2O2刺激下酶活性快速增加，随后稳定下降;没有H2O2刺激的对照组，酶活性和表达在整个实验期维持稳定。在氧化应激早期表现为TTase表达上调，提示TTase在早期防御中的重要性，发挥着保护晶状体蛋白和酶的重要功能;但长期处于氧化应激状态下，超过TTase对抗氧化应激的能力，则会损害TTase系统，导致TTase活性和含量下降。

TTase特异性地使晶状体蛋白质氧化形成的二硫键断裂，并在其活性位点的Cys与对应二硫化物之间进行巯基－二硫键交换，从而恢复蛋白质的自由巯基，调控细胞内巯基/二硫化物的稳态，阻止晶状体蛋白形成交联。除了作为细胞内防御系统对抗氧化损伤而保护晶状体蛋白，TTase对晶状体氧化损伤也有修复的作用。TTase可通过还原蛋白质谷胱甘肽二硫化物等过程来调节和修复晶状体中含巯基的蛋白质或酶的活性，恢复其还原状态和生理功能，保持糖代谢和提供维持细胞活力所需的能量［19］，有助于晶状体透明性的恢复。脱氢抗坏血酸是一种存在于房水和晶状体的氧化物，能诱导白内障的形成;TTase催化脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸［20］，保护晶状体。TTase可以还原在氧化应激作用下晶状体中某些活性降低或丢失的抗氧化酶。Lou［21］等实验发现，将兔晶状体上皮细胞暴露于0.5 mmol H2O2，5分钟后晶状体中重要的糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G-3PD)的活性丢失至20%，加入重组人晶状体TTase(RHLT)后，其活性增加至60%;经胱氨酸去巯基灭活的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，加入RHLT 30分钟后活性恢复至初始水平的90%。体外研究中谷胱甘肽S-转移酶(GST)的催化功能很容易通过S-半胱氨酰化而失活，通过TTase催化后活性可恢复。通过对TTase和GST的对比研究，发现晶状体TTase在还原晶状体蛋白质巯基混合的二硫化物活性方面比GST高60%－70%，TTase和GST联合作用于晶状体巯基二硫化物混合物没有累加效应［20］。谷胱甘肽还原酶(GR)在维持晶状体的巯基基团也发挥了关键作用，其活性随着晶状体老化和白内障形成降低;而TTase能有效恢复人白内障晶状体GR活性［22］。在氧化应激的条件下培养的人和兔眼晶状体上皮细胞，当其他氧化防御系统如GPx和GR严重灭活时，TTase仍有显著的抗氧化的功能。Xing［23］比较不同年龄组的正常人晶状体发现，随着年龄的增加TTase和TRx系统的活性逐渐丢失，可能导致老化人口患白内障的风险增加。

4 结束语

综上所述，TTase在保护晶状体蛋白质免受氧化损伤，防止晶状体的白内障形成中发挥重要作用。TTase在晶状体的表达和活性的研究对于探讨白内障发病机制有重要意义，并将为白内障的药物预防和治疗提供广阔的前景。

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