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植物诱导型启动子的研究进展*

2011-08-15王志新李文滨

大豆科技 2011年3期
关键词:赤霉素转基因元件

王志新,赵 琳,李文滨

(东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室,哈尔滨 150030)

高等植物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。其中,转录水平的调控是由顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现的,是表达调控的关键环节。植物基因的启动子序列包含多种重要的顺式作用元件,在转录水平上参与调控下游相应基因表达,从而使植物能够适应复杂多变的生长环境。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制,并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。

植物启动子按其转录方式可以分为:组成型、组织特异型和诱导型启动子[1]。但不具有绝对性,如绝大部分果实特异性启动子同时存在乙烯应答元件,故也可看作是乙烯诱导型启动子,所以不同的研究方法和分析角度会对同一启动子的分类产生差异;同样,一种类型的启动子也往往会具有其他类型启动子的特性。

由于信号刺激而具有转录活性的启动子称为诱导型启动子[1]。诱导型启动子大多具有以下共同特点:(1)启动子的活化受物理或化学信号的诱导;(2)具有增强序列、沉默序列或类似功能;(3)感受特异性诱导的序列都有明显的专一性;(4)部分该类型的启动子同时具有组织特异性表达的特点[2]。

与组织器官特异性启动子相比,该类启动子可以快速有效地诱导转录基因的“开、关”,可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号,诱导基因表达;也可以随时解除胁迫,停止表达[2]。这样不仅不会造成植物体内资源的浪费,又可提高植物的抗性。

1 植物诱导型启动子的种类

诱导型启动子常以诱导信号命名,可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、激素诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子等。以下就几种常见的诱导型启动子类型加以阐述。

1.1 光诱导启动子

在高等植物的发育过程中,光不但直接参与光合作用,而且作为一种重要的信号调控相关基因的表达。光调控基因通常包括与光合作用和光形态发生作用有关的基因,此类基因的转录调控大多是通过光诱导型启动子来实现的。

大量的研究表明,光应答启动子包含着许多正、负调控元件[2],但是存在于光应答启动子中的顺式元件也存在于其他非光应答启动子中,可能是这些顺式元件的特殊组合方式指导光调控基因的表达,但这种特殊组合方式不是专一的、保守的,没有哪一种类型的顺式元件存在于所有光应答启动子中,也没有哪一个顺式元件能单独使启动子具有光应答的特性。研究发现在光调控基因启动子区段往往存在着若干光应答元件(light response elements,LREs),如G-box、boxⅠ、boxⅡ、boxⅢ、A/T富含区和Gap-box等,它们对光调控的转录激活是必需的[3]。

G-box是植物通用信号诱导元件,最早从编码RbcS基因的上游区鉴定出来。它高度保守,通常含有一个核心序列5'-CACGTG-3'[4],且必须和其他光反应元件相互作用才能起到光调节的功能。目前已经分离得到了一些G-box结合蛋白,它们具有bZIP结构。另外研究发现MYC(myelocytomatosis oncogene)蛋白不仅可以和E-box结合,也可以和G-box结合,E-box的序列为5'-CANNTG-3'。boxⅠ又称GATA元件,含有5'-GATAA-3'序列。一些光应答基因中含有单一的GATA元件,但是也有一些含有多个拷贝。GATA元件的缺失或突变都会导致启动子光应答能力的下降。

1.2 伤诱导启动子

当植物受到人为的创伤或害虫造成的机械损伤后,会产生一些小分子物质和多糖,它们作为信号物质诱导一系列防御基因的表达。防御基因不仅可以促进伤口的愈合,而且还可以抑制病原菌的侵袭,主要包括几丁质酶、β-1,3-葡萄糖酶等水解酶类、结构蛋白、蛋白酶抑制剂等[5]。研究最早的损伤基因是土豆和西红柿的蛋白酶抑制剂基因PinⅡ。研究人员将土豆PinⅡ启动子从-1300~-700缺失,发现基因活性大大降低,但是仍然具有伤诱导的活性,因此诱导区域应该在启动子的近端区域。随后研究又将-1300~-195区段与-90CaMV35S启动子融合,发现嵌合启动子具有伤诱导的活性,因此-700~-195区段控制该基因的伤诱导表达[6]。

1.3 激素诱导启动子

植物激素调节植物细胞的伸长、分裂和分化,并且控制植物体的生长、发育、休眠、萌发、生根、开花、结果以及果实成熟等过程[1]。对植物激素诱导启动子的研究,有助于进一步了解植物的生长发育过程中植物激素作用的机制。目前研究较多的有生长素效应启动子、赤霉素效应启动子、脱落酸效应启动子、乙烯效应启动子、水杨酸效应启动子和甲基茉莉酮酸效应启动子等。

1.3.1 生长素诱导启动子 生长素诱导启动子含有多个生长素应答元件(Aux responsive element),这些元件在不同来源的生长素效应基因中具有一定的保守性。有些生长素诱导启动子中含有5'-TGTCTC-3'序 列 和 与 它 相 似 的 5'-[G/T]GTCCCAT-3'序列,有些生长素诱导启动子中含有G-box和TGA-box[7]。Wang等[8]分离了烟草内源β-1,4-葡聚糖酶 基 因(cellulose)NtCel7上游1470bp DNA序列,将NtCel7启动子下游与GUS基因融合构建植物表达载体转化大豆、番茄和拟南芥。研究发现,该启动子在异源植物内与生长素诱导有关,而与赤霉素、蔗糖和乙烯诱导无关。

1.3.2 赤霉素诱导启动子 赤霉素(gibberellic acids)在细胞伸长、开花、花色、萌发时胚乳中大分子储藏物的运动等方面都有十分重要的作用。目前对赤霉素诱导基因表达的研究主要集中在谷类糊分层中的α-淀粉酶基因的启动子中。大麦高等电点的α-淀粉酶基因启动子中,赤霉素应答元件至少是由一个嘧啶盒或[C/T]CTTTT[C/T]或TAACA[A/G]A盒和TATCCAC盒组成,这些元件对赤霉素的正常应答是必需的,因此把它们通称为赤霉素应答复合物。大麦低等电点α-淀粉酶基因启动子中,在嘧啶盒的上游还有一段序列影响赤霉素的应答[9]。嘧啶盒、TAACA[A/G]A盒、TATCCA[C/T]盒存在于许多禾谷类α-淀粉酶基因启动子和其他赤霉素应答启动子中。在一些等电点高的α-淀粉酶基因启动子中,缺失嘧啶盒并不降低启动子赤霉素应答的活性[10],但是大麦低等电点α-淀粉酶基因启动子Amy32b中的嘧啶盒的突变或缺失会大大降低启动子的赤霉素应答效应。TATCCAC盒的突变部分影响启动子的应答效应,但是TAACAAA盒的突变则导致启动子的赤霉素应答效应完全丧失。

1.3.3 脱落酸诱导启动子 脱落酸(ABA)在植物的胚胎发育、种子休眠、种子萌发以及植物对逆境胁迫的反应等过程中起着十分重要的调节作用,因此关于脱落酸启动子的研究也是植物启动子研究的热点和前沿。研究发现,ABA诱导表达基因启动子存在一个PyACGTGGC保守序列,该序列在小麦胚胎发生晚期表达基因E3中首次被确定为ABA应答元件[1],核心序列为A/GCGT。在含有脱落酸应答元件的启动子中,一般都存在G-box结构。研究者推断启动子的ABA诱导活性需要两个ACGT元件或者一个ACGT元件和一个CE元件,但是ACGT元件和一个CE元件的旁侧序列对启动子的活性也有一定的影响[11]。

1.3.4 水杨酸诱导启动子 当遭遇病原菌浸染的时候,高等植物会在病原菌浸染的部位产生免疫物质,这种植物自身的免疫反应成为系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)。研究发现,诱导SAR的一个重要信号物质就是水杨酸(salicylic acid,SA)。无论是内源水杨酸浓度的增高还是外源添加水杨酸,不仅能增强植物的抗性,而且还能刺激一系列病程相关蛋白(pathogenesis-related,PR)的表达。最早的水杨酸诱导元件是在CaMV35S启动子中发现的[12]。研究人员在对35S进行缺失分析的时候发现,用2mmol/L的水杨酸处理转基因烟草时,全长35S启动子和-90-35S启动子的转基因烟草植株叶片中的GUS活性明显增高,而-46-35S启动子转基因植株叶片的GUS活性没有明显的变化,说明受水杨酸诱导的元件可能在-90到-46之间。随后他们又将-90到-46区段缺失的35S启动子与GUS融合转化烟草,发现转基因烟草不受水杨酸诱导。随后研究者猜测-83到-63区段的激活序列(activation sequence1,as-1)可能应答水杨酸的诱导,他们将该区段与-46-35S启动子融合并转化烟草,研究发现转基因烟草受到水杨酸的诱导,因此,水杨酸的应答序列就是as-1元件,该元件的核心序列为5'-TGACG-3'[11]。

1.4 温度诱导启动子

1.4.1 高温诱导启动子 植物与其他真核生物一样,包含有许多热激基因。当植物暴露在高温下,植物就会在短时间内合成一些特异蛋白,这些蛋白对植物有保护作用。目前已经分离得到了许多热激蛋白基因的启动子,在这些启动子中都存在着热激元件(HSE),一般情况下真核生物热激元件的序列为5'-[nGAAn][nTTCn]-3'。在植物中,HSE一般位于TATA-box上游,一致序列为5'-aGAAg-3'[14]。此外,植物热激基因的启动子中也存在一些富含AT的序列,AT富含区的长度和位置是多样的,如果缺失AT富含区域,就对启动子的活性有影响。

1.4.2 低温诱导启动子 与高温一样,低温对植物也是一种胁迫,当寒冷或霜冻到来之时,耐低温的植物体内就会发生一系列的生理生化变化,这些变化包括蛋白质、脂类和碳水化合物组分的改变以及一些新物质的合成。目前已经分离得到了许多冷诱导基因,并对它们的相应启动子进行了深入的研究。在拟南芥中,存在着众多与冷诱导有关的基因,如KIN1,COR15,LTI7848[15]等。研究发现上述启动子都含有CCGAC基序,又称为CRT/DRE元件,参与冷诱导和脱水应答[16]。

1.5 生物胁迫型启动子

当植物受到真菌、细菌、病毒等病原微生物浸染时,植物体内相关保护蛋白基因被激活,从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害,调控这类保护蛋白基因表达的启动子即生物胁迫诱导型启动子。Zheng等[17]从杂交三倍体白杨基因组DNA中分离得到一个TIP特异启动子,序列分析发现,在该启动子区段包含多个与植物保卫基因激活有关的顺式调控元件,如GC富含区段、AT富含区段和W-box等;据此推测,该TIP特异启动子可能是一个病原诱导启动子且是防御相关基因表达所必需的。

2 诱导型启动子的研究方法

与功能基因的研究相比,有关启动子功能研究和分析方法的报道要少得多,而且这些报道都是零星地分散在一些文章中。目前,研究启动子功能的方法主要有瞬间转化分析、转基因植物的稳定表达检测、缺失突变分析、点突变、凝胶阻滞技术(EMSA)、酵母单杂交技术等,以及近年来发展起来的RNA干涉技术等,对于诱导型启动子的研究,大多采取以下几种方法。

2.1 瞬时表达分析

该技术是将一段启动子序列与报告基因融合构建表达载体,通过基因枪轰击法转化植物细胞,通常转化烟草叶盘,并进行GUS组织化学染色分析检测。瞬时表达分析是确定一个启动子是否具有启动活性最常用的方法,并不能说明启动子是否具有诱导性。

2.2 转基因植物的稳定表达分析

在研究启动子尤其是诱导型启动子的功能时,为了获得准确可靠的结果,通常采用转基因稳定表达的方法,即构建启动子与报告基因融合的植物表达载体进行植物遗传转化,获得转基因植株,通过分析不同条件下转基因植株中报告基因的表达来判断启动子的诱导活性。

2.3 缺失突变分析

在确定某一段DNA序列为启动子之后,通常通过去除启动子部分序列来构建缺失表达载体,然后进行植物转化,根据转化植株中报告基因的表达情况分析启动子的诱导型元件作用序列。Wang等[18]分离了金华中棉(Gossypiun arboretum var.jinhua)光诱导基因cab5'端上游l009bp的调控序列并构建了启动子全长和197bp、504bp、779bp的缺失体,GUS定量分析表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且504bp的启动子缺失体启动活性最高。

2.4 点突变分析

构建缺失表达载体确定的只是核心调控序列的大体范围,为了进一步精确定位其位置可通过碱基突变的方法构建突变体来实现。或者,当确定一个顺式作用元件的核心序列后,也可通过碱基突变的方法确定是哪一个碱基起决定作用。突变时通常遵循碱基颠换的原则,即嘌呤与嘧啶置换。

2.5 凝胶阻滞技术(EMSA)

凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种简单快速检测蛋白质与特异DNA序列结合的技术,可用于体外研究启动子与蛋白质的结合情况,以确定启动子的核心顺式作用元件[19]。EMSA的原理为:当DNA片段结合蛋白质之后分子量增大,其在电场作用下的迁移速率将远远小于未结合蛋白质的DNA分子。因此,可以将双链DNA片段的一端用同位素或地高辛标记,再与蛋白质提取物混合,再将混合物电泳,如果目的DNA与特异性蛋白质结合,则其向阳极移动的速度受到阻滞,通过放射性自显影技术,就可找到DNA结合蛋白的样品。

2.6 酵母单杂交技术

酵母单杂交技术(yeast one-hybrid)是1993年由Li等[20]在酵母双杂交的基础上建立的,是一项分析DNA与蛋白质尤其是启动子与转录因子之间相互作用的重要技术。酵母CAL4蛋白是一种转录因子,GAL4的DNA结合结构域(BD)可激活酵母半乳糖苷酶基因的上游激活位点,转录激活结构域(AD)可与RNA聚合酶或转录因子TFⅡD相互作用,BD和AD在结构和功能上是相对独立的。当将GAL4的DNA结合结构域编码序列用特异的DNA序列取代时,其编码产物能与目的DNA相互作用。这样仍可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶,启动下游报告基因的转录。进行酵母单杂交实验时,先将含有目的启动子序列和报告基因的质粒转化酵母细胞,再将文库cDNA片段与GAL4转录激活结构域融合构建cDNA文库质粒并重复转化同一酵母细胞,最后根据下游报告基因的表达情况分析与启动子相互作用的蛋白。

3 诱导型启动子的研究展望

由于诱导型启动子能够有效地调控下游基因的表达,最大限度地减少由于外源蛋白在转基因植物体内的积累对其自身造成的伤害,因而得到广泛的研究。Kasuga等[21]将rd29A::DREB1A和35S::DREB1A转化烟草,与rd29A::DREB1A转基因植株相比,35S::DREB1A转基因烟草明显出现生长滞后现象;rd29A::DREB1A转基因植株的胁迫耐性也明显高于35S::DREB1A转基因植株。Pellegrineschi等[22]用胁迫诱导型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达,提高了转基因小麦对干旱胁迫的耐性,而且没有引起明显的畸形。因此,利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在改良作物的抗性中成为目前研究的热点。然而,目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此,对于新的诱导型启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用,以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

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