HPLC法测定血浆中辛伐他汀浓度

刘 晶 ，朱立勤 ，孙秀娟

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市第一中心医院药剂科，天津300192；3.天津市民政局老年病医院，天津300110）

辛伐他汀为临床常用治疗高脂血症的药物，对胆固醇有抑制作用，临床主要用于治疗原发性高胆固醇血症[1]。由于辛伐他汀为前体药物，在血中含量较低，因此其血药浓度测定较为困难。本实验采用HPLC法测定，简便灵敏，用于临床上辛伐他汀血药物浓度监测，取得良好效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（LC-10AVP输液泵，SPD-10AVP紫外检测器，ANASTAR色谱工作站）；AR2140型电子分析天平；色谱分析柱 Kromasil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm，天津市琛航科学仪器有限公司）；辛伐他汀片（浙江海正药业集团有限公司，批号：091208，20 mg/片）；辛伐他汀标准品（中国药品生物制品检定所提供，批号：090402）；内标物洛伐他汀标准品（中国药品生物制品检定所提供，批号：090402）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。血浆样品由天津市第一中心医院提供。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（60∶40）；紫外检测波长：237 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；灵敏度：0.002(AUFS)；进样量：20 μL。

1.2.2 辛伐他汀储备液的制备 精密称取辛伐他汀标准品10 mg，加甲醇溶解稀释于50 mL容量瓶中摇匀，再精密吸取此溶液10 mL，加甲醇溶解并稀释于50 mL容量瓶中，制备成40 μg/mL的辛伐他汀储备液。

1.2.3 内标液配制 精密称取内标物洛伐他汀10.0 mg，加乙腈溶解并稀释于100 mL的容量瓶中，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的内标储备液。再精密吸取此溶液0.2 mL，加乙腈溶解并稀释于100 mL的容量瓶中，制备成200 ng/mL的内标供试液。

1.2.4 血样处理 取标准血浆溶液0.5 mL，置于旋涡混合器上混匀5 min，用高速离心机（13000 r/min）离心5 min，取出上清液,置于60℃水浴上用氮气吹干，用100 μL流动相复溶后，高速离心，取上清液20 μL待测。

1.2.5 辛伐他汀血浆标准曲线的制备 精密吸取空白血浆500 μL，置于具塞刻度试管中，精密加入辛伐他汀储备液(40 μg/mL)适量，再精密加入内标供试液 500 μL，分别制成浓度为 5、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的系列标准血浆溶液。按血样处理方法操作以不同浓度辛伐他汀系列溶液的辛伐他汀峰面积（As）和内标峰面积（Ai）来计算Y（Y=As/Ai），以Y值为纵坐标，辛伐他汀浓度C为横坐标进行直线回归。

2 结果

2.1 辛伐他汀色谱图 分别将空白血浆和辛伐他汀血浆标准溶液按血样处理方法操作后进样，得出色谱图。血浆中内源性杂质不影响辛伐他汀与内标的分离测定，辛伐他汀与内标的保留时间分别为8.9 min和6.7 min。色谱图见图1。

图1 血浆中辛伐他汀色谱图A空白血浆，B辛伐他汀血浆标准溶液；1.内标物洛伐他汀 2.辛伐他汀

2.2 辛伐他汀血浆标准曲线 辛伐他汀在5～1000 ng/mL范围内，血药浓度与峰面积比有良好线性关系，其回归方程为Y=0.0046C+0.122，r=0.9997。以信噪比S/N=3∶1计，辛伐他汀最低检测浓度为2 ng/mL。

2.3 回收率及精密度 将10、100、500 ng/mL的标准血浆溶液按血样处理方法项下操作，分别进样5次，将辛伐他汀峰面积（As）与内标峰面积（Ai）之比Y代入标准曲线计算辛伐他汀血浆浓度，以测得值与加入值之比计算方法回收率。以1 d内测得的辛伐他汀浓度计算日内精密度，以1周内5次测定的辛伐他汀浓度计算日间精密度，见表1。

表1 回收率及精密度

3 讨论

3.1 预处理方法选择 目前国内外文献报道血浆样品预处理的方法多采用萃取法和沉淀法。本实验曾尝试用萃取法进行血浆样品的预处理，使用含5%异丙醇的二氯甲烷等多种试剂进行提取，发现萃取操作复杂、耗时长，得出的色谱峰杂质较多，提取量与浓度之间线性不理想，二氯甲烷等有机溶剂毒性较大。因此本文采取沉淀法完成样品预处理。文献报告的沉淀法对仪器要求较高[2]，血样反复用乙腈沉淀蛋白，处理过程复杂，结果准确性差，不能满足本实验检测要求。本实验对沉淀法进行了改进，用乙腈沉淀蛋白吹干、复溶再进行色谱分析，操作过程简便快速，提高了准确性和精密度。

3.2 沉淀试剂的选择 一般血样处理中沉淀蛋白常用试剂为甲醇和乙腈[3-4]，本实验在筛选条件时根据文献选择了甲醇、乙腈分别作为沉淀试剂，结果乙腈较前者的沉淀效果更为完全，杂质峰较少，因此本实验选用乙腈用作蛋白沉淀剂。

3.3 流动相筛选 实验中选择了多种流动相体系，包括不同比例的甲醇∶水、甲醇∶乙腈∶水、乙腈∶水等作为流动相来筛选实验条件，结果发现与甲醇相比，乙腈的洗脱能力强，以60∶40的乙腈∶水作为流动相，可以满足色谱系统检测的要求，并且系统分离效果较好，峰形对称，柱效高，保留时间适宜。因此本实验选择乙腈∶水（60∶40）作为流动相。

近年来他汀类药物在心血管疾病的治疗方面起到非常重要的作用，其中辛伐他汀是此类药物中使用较为广泛的一种。本实验采用高效液相的方法测定辛伐他汀血浆浓度，方法灵敏度高、操作简便、回收率高、精密度好，可满足临床血药浓度测定的需要。

［1］Wang D,Qin F,Chen L,et al.Determination of lovastatin in human plasma by ultra-performance liquid chromatography eLectrospray ionization tandem mass spectrometry[J].BiomedChromatogr，2008，22(5)：511

［2］申屠建中，章霞，陈志根，等.固相萃取反相高效液相色谱法检测人血浆中辛伐他汀浓度[J].药物分析杂志，2002，22(1)：18

［3］王东，秦峰，陈凌云，等.超高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中的辛伐他汀[J].色谱，2008,26（3）:327

［4］张红，徐文炜，胡晓，等.人血浆中辛伐他汀的HPLC-MS/MS测定[J].中国医药工业杂志，2006，37（12）:833