帕金森病模型小鼠吸入硫化氢预防神经退行性病变和运动失调

（李战永摘 杨卓审校译自Antioxid Redox Signal,2011,15:343-352）

帕金森氏病是神经退行性疾病之一，神经毒素甲基苯基四氢吡啶（MPTP）可致人和动物出现帕金森病的症状和生化改变。硫化氢（H2S）已被证明具有神经保护作用。本研究使用8～10周的C57BL/6J小鼠造模。采用腹腔注射MPTP溶液（20 mg/kg）的方法，每2小时1次，共4次，每只小鼠MPTP总量80 mg/kg。实验动物分2大组：MPTP给药组和对照组。MPTP给药组又分空气吸入组和H2S吸入组。对照组小鼠腹腔分次注射与MPTP给药组小鼠等量的生理盐水。从给药当天开始，MPTP给药小鼠置于定制的塑料箱中，每天吸入空气或混有体积分数为4×10-5H2S的空气8 h，连续吸入7 d。每天监测吸入不同气体小鼠的直肠温度。给药后第7天观察各组小鼠的行为学改变，包括旷场实验、旋转实验和悬尾实验。并作组织学检查包括酪氨酸羟化酶（TH）含量检测，TH免疫印记分析，胶质细胞活性测定，TUNEL染色以及免疫荧光共染等。给药后第1、3、7天分别取脑组织，测定脑内谷胱甘肽含量的动态变化。

研究发现，无论吸入H2S与否，MPTP给药当天均可显著降低小鼠的体温，H2S吸入组小鼠在给药后第1天和第2天能降低体温，但给药后第3～6天未发现体温降低。与对照组相比，MPTP给药后可降低旷场实验中小鼠的运动距离和直立次数，减少小鼠在旋转实验中的停留时间，明显延长悬尾实验中小鼠的静止时间。H2S吸入7 d后发现，MPTP给药导致的旷场实验中小鼠的运动能力和直立活动降低得到改善，小鼠在旋转实验中未见运动障碍，H2S吸入能抑制MPTP导致的悬尾小鼠静止时间增加（P<0.05）。免疫组化结果显示，MPTP给药7 d后，黑质和纹状体内的TH活性显著降低，而H2S吸入7 d后可抑制这种TH减少。该结果也经免疫印迹分析方法得到证实。TUNEL染色结果证实，MPTP给药后1 d可增加黑质核团内凋亡细胞的数量。相反，H2S吸入能抑制MPTP给药所致的凋亡。免疫荧光双标记表明TUNEL染色阳性的胞核仅见于黑质，尤其是在TH阳性的细胞核区域。尽管大多数TUNEL阳性细胞核没有被TH阳性细胞覆盖，但TUNEL、TH和DAPI三标法显示有少量TH阳性神经元包含有TUNEL染色阳性的细胞核。这些结果提示至少部分TH阳性神经元因凋亡而丢失。H2S吸入可显著减少MPTP导致的TUNEL阳性细胞。为进一步确认MPTP给药后黑质内凋亡细胞的类型，研究采用TUNEL染色分别与神经胶质酸性蛋白（GFAP）和离子钙接头蛋白抗体（Iba-1）双标记的方法。结果GFAP阳性的星形胶质细胞没有覆盖任何TUNEL阳性细胞，而Iba-1阳性的小胶质细胞包围TUNEL阳性细胞。实际上，TUNEL、Iba-1和DAPI三标记显示大多数TUNEL阳性细胞与小胶质细胞差别明显，提示凋亡的神经元被激活的小胶质细胞吞噬。上述结果表明，MPTP导致黑质内TH阳性神经元凋亡，而这些凋亡的神经元又被激活的小胶质细胞吞噬。免疫荧光染色表明对照组小鼠脑内黑质和纹状体很少有活性的小胶质细胞和星形胶质细胞，MPTP给药后第1天即可增加黑质内活性小胶质细胞和星形胶质细胞的活性。纹状体内，激活的小胶质细胞在MPTP给药后第1天增多，而星形胶质细胞在MPTP给药后第7天增多。H2S吸入能对抗MPTP给药所致的黑质和纹状体内的星形胶质细胞和小胶质细胞激活。为探究H2S吸入具有神经保护作用的分子机制，本研究测定了核因子E2相关因子2（Nrf2）调节的基因编码抗氧化蛋白和去毒酶（GST Mu1，NQO1，HO-1，GST A4，GCLC）的表达水平。结果发现MPTP不影响GST Mu1、NQO1和HO-1表达，但降低GST A4和GCLC的表达，H2S吸入增加MPTP给药后第1天小鼠的上述5种蛋白基因的表达。这些结果提示吸入H2S可通过上调Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白来发挥其神经保护作用。此外，MPTP在给药后第1、3、7天，无论是否吸入H2S，均未显著影响黑质和纹状体内还原型谷胱甘肽（GSH）水平以及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比率（GSH/GSSG），提示谷胱甘肽水平降低与MPTP和（或）H2S无关。

本研究显示，连续7 d每天吸入体积分数为4×10-5的H2S，可对抗MPTP导致的帕金森模型小鼠的神经退行性变和运动失调。H2S吸入的神经保护作用与其显著减少MPTP所致的黑质和纹状体内含TH神经元丢失有关。H2S吸入可抑制MPTP给药后第1天黑质纹状体内神经元的凋亡和神经胶质增生。H2S吸入还能上调黑质纹状体区Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白，该作用至少部分与上调Nrf2依赖性抗氧化保护机制有关。总之，本研究结果证明，H2S吸入可对抗MPTP给药后对小鼠造成的毒性作用。