生物样品中唾液酸和神经节苷脂的测定

高 静

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

0 介绍

神经节苷脂是一类含有唾液酸的酸性鞘糖脂，是神经细胞膜的重要组成成分，结构中含有一种或多种成分的唾液酸，更确切的说，神经节苷脂是由鞘氨基醇与脂肪酸相结合，然后通过酰胺键连接到包含一种或多种唾液酸的低聚糖链上［1］。在物理条件下，唾液酸分子中含有一个负电荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年来，随着对细胞膜表面糖类生理功能研究的日益重视，神经节苷脂的研究也日趋受到科学界的关注，特别是随着神经生物化学和神经药理学的发展，对神经节苷脂的代谢及其生物学作用研究已经成为神经科学的重要课题［2］。神经节苷脂在国内大多数依赖进口，虽然国内外已报道了多种分离纯化的方法，但大多都有操作步骤繁琐、溶剂用量大等不足之处。目前国内外的研究主要集中于其与生物膜其他有效成分之间的相互作用，而对神经节苷脂的分离方法的最佳选择未给予详细的报道。因此，本文就多种分离纯化方法做一下比较总结，对其分离过程起到一定的帮助。

1 唾液酸

唾液酸的分析从它们释放时开始，将样品纯化后用不同技术进行分析，下面就对不同分析检测方法做一下介绍。

1.1 样品制备

1.1.1 唾液酸的提取方式

一般使用两种方式处理：酸水解及固定化酶处理。

酸水解是应用最广泛的处理方法。用恒温箱或者加热器将反应保持在加热条件下（70℃～90℃）。最常用的酸是硫酸浓度为25～100mmol的酸溶液［4］。其他研究者曾经将不同的试剂用于水解，如稀释的盐酸、微波处理的乙酸、次硫酸钠或者三氟醋酸，这些都可以减少水解时间。

对于不同的酸水解都要做对照实验（25mmol HCl，25mmol三氟醋酸TFA，25mmol H2SO4）。用盐酸或TFA水解是最好的选择，虽然经过2h的水解会损失20％左右［5］，但是操作简便。通过从微生物中获得的神经氨酸酶对唾液酸进行水解时损失最小，但控制生物样品的反应并不容易，因为它的释放依赖于组织结构以及酶的来源情况。

酶法处理效果比水解的效果要差，因为并不能提取所有非游离唾液酸。相反，酸水解能够提取所有非游离唾液酸，但是可能会对一部分造成破坏，并且能够参与后面的反应过程，各有利弊。

经过实验比较，考虑到酶的成本及实际的反应效果，我们认为不管是采用色析法还是色度法，酸水解都是最常用的处理方法，因为这种方法重现性好，容易操作且成本相对较少。

1.1.2 纯化

对于早前的硅酸盐测定，阴离子交换柱是纯化试样的最常用的选择。其他的纯化方法还有固体萃取如SepPak C18柱［6］，或者对样品进行超速离心，一般在水解后用于消除杂蛋白。另外一种可能是将阴离子交换柱与超速离心联合应用对样品进行处理，阴离子交换柱是最有效的提纯方法，但同时也是繁琐且耗费大的方法。因此，只有当样品非常复杂的时候才使用这种方法。相反，SPE柱可以对样品进行快速简便的分离纯化，但只有在干扰因素很小的条件下才适用，因此推荐在纯化样本后使用［7］。

1.2 唾液酸的测定

1.2.1 分光光度法

考虑到唾液酸的结构与糖类似，因此将分光光度法作为测定唾液酸的专用技术。但是采用这种方法的缺点是选择性比较差，如果没有之前的纯化步骤就不能用此法测定，而且不能用其区别不同结构的唾液酸。测定唾液酸基本上要用到三种比色法：间苯二酚法，丙二酰硫脲测定法及酶测定法［8］。

应用最广泛的分光光度法是由Svennerholm发明的［9］，后人对这种方法又做了一定的修正，即用阴离子交换法来提高纯度。采用这种方法时在蔗糖与间苯二酚之间发生反应。由于唾液酸是糖脂类神经节苷酯物质所含有的特征基团，因此当与间苯二酚反应生成紫色复合物可用于神经节苷脂的含量测定。本法主要用于人体组织和生物体液的检测，但一些研究者已经将其用于乳制品检测当中，如牛奶制品和婴儿奶粉的检测。

1.2.2 液相色谱法

液相色谱法也是测定唾液酸较常用的方法，当样品没有被衍生化的时候，最常用的方法就是紫外检测离子对的方法。这种方法最初是由Spyridiaki与Siskos联合研究出来的［10］，他们通过实验模拟提高了以下物质检测时的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙酰基-9-O-乙酰神经氨酸等。在分析中使用了多种亲脂的阳性离子对，如四辛基溴化铵（TOA-Br）三异丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用时一般选用TIP，因为它的强度和分离度更好，但在操作中必须要注意pH的控制，（最佳值为3.5），这是决定因素。但是实验发现，当这种方法应用到血清、尿液、唾液当中时，只能区分两种形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en）［11］，在纯化步骤中必须除去蛋白质。由于其限制条件较多，因此在分析结构较多的唾液酸混合物时不推荐使用本方法。

1.2.3 气相色谱法

气相色谱法（GC）与质谱法联用起初是用来鉴定苷脂键及衍生反应后的氧代神经氨酸，Zanetta等人在此基础上研究了一种非常有效的方法，用来测定唾液酸标准液及生物体液如马血清及牛、羊、马的下颚下腺粘蛋白等［12］。这种方法是在无水甲醇和使用七氟酸酐形成的挥发性衍生物存在的前提下，通过重氮甲烷酐的甲基酯化进行气相色谱/质谱电子轰击的。这种方法能够区分大部分的唾液酸，包括O-酰化的Neu5Ac，Neu5Gc和8-O-邻甲基和8-O-硫酸衍生物以及1，7-唾液酸内酯。在后面的研究中，这个研究小组对本方法做了小的修改，从而对单糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素当中可以更好定位。样品仍可以用相同的反应容器，并按照分析唾液酸的方法用GC/质谱进行分析。相对于上面的方法，本法的测定范围更加全面，其应用前景也更加广泛。

1.2.4 电迁移方法

这种技术，尤其是毛细管区带电泳技术（CZE），是应用最广泛的分析检测糖类结构的方法之一［13］。因此当对唾液酸进行测定时也很容易操作。在最近的研究中，Ortner与Buchberger发展了一种简便、快捷并且重现性很好的方法来检测人血清和标准糖蛋白中的Neu5Ac和Neu5Gc［14］，这种方法是CZEMS（质谱），本法用对乙酰氨基酚作为内标物。CZE和MS的连用检测能够在排除基质干扰的条件下定量分析化合物，线性范围保持在10～100μg/mL内，同时LOD值为2μg/mL。

2 神经节苷脂

2.1 提取、分离、及纯化神经节苷脂

在动物组织中，最初以及最常用的的提取分离纯化方法是由Folch等人研究的［15］。第一步是使用不同比例的氯仿和甲醇提取总脂成分。第二步，将神经节苷脂从此成分中分离纯化出来，利用盐在水相中的分配比不同提取。这些基本的方法随着发展已经发生了一些变化，但最终目标都是为了提高目标产物的含量。

2.2 神经节苷脂的测定

总神经节苷脂量可以通过分离纯化唾液酸内容物来定量，量化结果可以用脂键联合唾液酸的方式表达。

不管总神经节苷脂的鉴别还是定量都需要一种有效的分离方法，主要的方法有薄层色谱法（TLC），高效薄层色谱法（HPTLC）以及层色谱法（LC）［16］。

2.2.1 薄层色谱/高效薄层色谱

薄层色谱法属于传统技术，受到广泛应用。目前，高效薄层色谱法使用的是二氧化硅60，能提供高分辨率来分离神经节苷脂。不使用以往常用的塑料和玻璃板块是因为间苯二酚-HCl常会对板块染色，而铝块是因其不能抵抗酸的腐蚀。对于样品的应用，脂类结合的唾液酸推荐量是5～10μg。

关于显影剂，总混合物的比例为CHCl3：MetOH：0.2％CaCl2（55：45：5，v/v/v）［17］，在此比例下能够表现良好的重现性，且能够分离出最重要的神经节苷脂（GM3and GD3），甚至能在其脂肪酸和鞘氨基醇碱基组成的基础上分离同种神经节苷脂。

2.2.1.1 经典测定方法

历史上，第一次用于染色的试剂是地衣酚，因为它能与糖的反应连接脂类，称粉甲紫染色法。其缺点是对神经节苷脂不具有专一性。斯文纳霍尔姆通过采用间苯二酚检测，在100℃下反应15min后，颜色变成了蓝紫色，中性和硫化的神经节苷脂则变成黄棕色，可以说这是最有效和敏感的检测试剂［18］。神经节苷脂可以通过与牛脑或其他物种或组织的标准样对照从而得到鉴定。为了准确观察样品板是否被显色试剂染色，需要用到光密度计，可将光密度计波长设为580nm进行测定。这种方法可重复操作，用于简单快速的测定动物组织中的神经节苷脂，甚至被用来确定细胞系和在样品中GM3和GD3以及GT3的神经节苷脂（GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b和GT1b）。另一种可能性是通过计算机辅助，在二维高效液相色谱处理后对密度进行成像，通过图像分析仪处理间苯二酚染色板和用计算机软件处理，允许测定GM3，GM1a，GD1a的线性在（r＞0.99）0.01nmol和5nmol之间［19］。光密度测定方法比电脑成像密度方法更加灵敏和精确。

2.2.1.2 质谱分析测定

质谱（MS）能够利用薄层色谱与高效液相色谱板来鉴别及定量神经节苷脂，虽然这种方法的灵敏性较TLC/HPTLC免疫染色法低，但这两种方法都可以作为薄层扫描法测定神经节苷脂的补充方法。薄层色谱法与快原子轰击（FAB）及质谱连用的优点归因于FAB-MS与气相、液相及超临界流体色谱仪是从生物反应表面得出结果的最有效方法［20］。TLCFAB-MS连用效率高且省时，但条件是仍然需要大分子的解吸附来增加灵敏度，并尽量减少基质中离子源的污染。因此，这种方法对样本的要求很高，在实际的应用中也会受到一定的限制。

2.2.2 液相色谱法与质谱法联用

近几年，一项液相色谱法与质谱法连用的技术逐步发展起来，实验证明，这种方法能够用于牛奶及婴儿配方中的神经节苷脂中GD3和GM3的测定。其GD3与GM3的重现性分别小于5％和14％，其覆盖范围在83％～87％［21］。由于本法的重现性比较低，所以不建议直接应用，在进一步研究及改进之后，相信本方法会成为一种可靠的分析方法应用到实际操作中去。

3 结论

分光光度法不仅可以将生物试样中的唾液酸进行定量分析，还可以将总神经节苷脂量进行分析测定，因此现在仍然是主要的分析方法。其应用方式主要为脂类与唾液酸的联合应用。而色谱技术能够将两种主要结构的唾液酸进行区分，这种方法不仅可以测定样品的原始数据还可以检测在临床环境中唾液酸代谢情况的变化（如癌症的早期诊断）［22］。

神经节苷脂在生物试样中的检测都需要一系列冗长的准备工作，如提取、分离以及纯化工作，但这又是最关键性的操作步骤，因为这些步骤可以从根本上反应出实际的损耗，要将所有干扰源消除非常困难，只能尽量减少。所以在分析过程中，一定要认真将此前期工作认真准备。

TLC/HPTLC仍然是分离神经节苷脂的重要方法。在所有方法当中，免疫染色法是鉴别神经节苷脂的最有效技术，而分光光度法可以实现定量。但后者由于具有专一性，因此具有更高的灵敏度和容量来得到结构信息，在实验操作中也应用的更加广泛。

神经节苷脂测定的未来趋势是利用质谱分析来阐释所有结构的神经节苷脂、糖链、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且调节他们的生物活性。本文对多种分析方法做了分析与比较，为神经节苷脂的开发利用提供了理论和一定的实验依据，这就是分析所有鉴别方法的意义所在。

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