影响牛胚胎采集效果的因素

2011-08-15韩志强李志强张洪涛陈国福张金友俞守绪

中国牛业科学 2011年3期

韩志强,李志强,张洪涛,陈国福,李伟,张金友,俞守绪,张亮

(1.黑龙江省农垦科学院畜牧兽医研究所,黑龙江哈尔滨 150038;2.黑龙江省农垦总局动物卫生监督所,黑龙江哈尔滨 150036;3.黑龙江省家畜胚胎移植技术开发中心,黑龙江尚志 150600)

胚胎移植技术主要包括供受体牛的选择,供体母牛的超数排卵,供体与受体牛的同期发情,胚胎的回收,胚胎质量的鉴别,胚胎的冷冻保存,胚胎移植,受体牛的妊娠诊断等[1]。超数排卵是胚胎移植中关键的技术环节,通过超数排卵技术可以获得大量整齐、优质的卵子,使得优良后代数增加几倍甚至几十倍,且好的超排效果还要具有高的可移植胚胎的回收率,才可以使得胚胎移植技术产业化进行,加快优良品种的扩繁[2]。现将胚胎采集方法及技术要点总结如下:

1 胚胎收集方法

供体牛超排发情后的第7 d采用二路冲卵管法进行非手术冲卵。首先将供体牛在保定架保定,用2%的普鲁卡因或利多卡因进行尾椎硬膜外麻醉,利多卡因剂量为5～10 mL。注射后1～3 min用手轻轻摇动牛尾,当牛尾呈“蛇样摆动”时即可进行操作。清洗阴门,然后用卫生纸擦干。在二路采卵管内插入不锈钢内芯使之挺直,将挺直的采卵管导入阴道达阴道穹窿,另一只手在直肠内协助。慢慢将导管插入子宫体,到子宫角内5 cm左右,拔出采卵管内的内芯约2 cm,再使采卵管沿子宫角弯曲方向进入子宫角深部。在这一过程中,助手每抽出约2 cm的内芯,术者将采卵管向子宫内送入相应的长度,直到将采卵管送到子宫角适当的位置。采卵管中的一路为“气路”,即通过它向气球内充气;另一路为“水路”。即向子宫内灌注和回收冲卵液。充气后的气球可将子宫角固定于子宫角大弯附近。此时,将采卵管内的不锈钢内芯全部抽出。首先用 50 mL注射器将20～30 mL冲卵液通过采卵管注入子宫角,再将冲卵液吸入到注射器内。冲卵液由20 mL逐渐增加到50 mL,每侧子宫角共用冲卵液500 mL。回收的冲卵液轻轻注入到500 mL的集卵杯把集卵杯的回收液在室温下(18～22℃)静置20～30 min,上清液通过过滤皿,最后将过滤皿内剩下的30～50 mL回收液摇动后倒入100 mm培养皿内。用PBS液冲洗2～3次,清洗液倒入100 mm培养皿内镜检、回收胚胎[3]。

2 影响供体牛胚胎回收率的主要因素

2.1 冲卵液内含抗生素

胚胎收集时由于过敏反应,子宫直接接触到抗生素过敏反应非常快,此时子宫角易开始肿胀,采胚时感触不到采卵管充气球的位置或是感觉不清子宫内液体的充盈程度,同时此刻子宫的收缩力降低,液体回流减缓或不回液,由于输卵管的一端开口于腹腔,进液不能回流子宫内压增高致使一定的液体和胚胎经输卵管流入腹腔内[4]。

2.2 子宫内进入气体

采用注射器推液、抽液的方式进行回收胚胎时不可将空气带入子宫角内,同样用封闭式回流采集胚胎时必须排除管内空气,如有空气进入子宫内会影响液体的回流,由于空气的存在使得采卵管回液口接触不到液体,又采卵管前部没有回液口致使角尖部液体不能回流,同时由于气体的存在,子宫角有限的空间内减少了进液量,由于气体使得子宫的肿胀,且气体在上层很难经回液口排除,液体回流不完全或无法回流必将导致胚胎的丢失[5]。

2.3 采卵管堵塞

粘液堵塞进回液口是牛只发情时分必的粘液没有完全流出而存留在子宫颈外口,当采卵管通过子宫颈口时粘液会从采卵管的进液口进到采卵管内,可能会堵塞几个进液孔,如粘液的量较大或粘度较高时采用封闭式进回液时进液的力度冲不开堵塞在进液口的粘液,采用注射器抽吸法时小力度也很难把粘液冲开。结果子宫内液体无法回流,压力过大会使得液体经输卵管前端流出或由于压力过大而使得子宫内壁受伤出血。

2.4 采卵管质量

由于采卵管质量的差异,管前端的固定球囊在外力作用下移动位置,如在子宫内液压的作用下管后移,气球向子宫角尖部移动堵塞采卵管回液口。此时液体无法回流,如减少气球围度会使角内的部分液体流到子宫体内进而流入对侧子宫角内,而影响到对侧角的胚胎收集。

2.5 冲胚液进入腹腔

个体差异有些牛只子宫角和输卵管之间的通透性非常好,如在进液时不将子宫角尖部捏住或提起会有部分液体经输卵管进入腹腔,造成胚胎的不可回收。

2.6 气球的稳定

在采集经产牛只时由于子宫弹力的降低,或是子宫内存留一定量的粘液,在固定气球时由于打气量稍有些小或是进液时采胚人员没有在球囊后固定球囊使得球后移动,如及时发现可补一定的气量继续进行采胚。如发现球囊已退回到子宫角分叉部应充分将角内液体回流后采对侧角再进管时要适当浅一些,防止由于另一侧采胚时的液体流入所造成的影响。

3 提高胚胎回收率的方法

3.1 应用抗过敏药

如发现供体牛只有轻微过敏反应时此刻在注射抗过敏药已不可避免子宫的肿胀,而且还会影响到采另一侧子宫角的采卵管固定等工作。如发现较晚则会影响到采胚工作甚至牛只的生命。如发现牛只摇头,并流涎,外阴红紫既是过敏症状,待发现皮下起疹时应加量注射抗过敏药物,此时如还没采对侧子宫角时应加快速度将采卵管送到位置以免回收不到胚胎。因此采用提前注射抗过敏药可以有效避免子宫肿胀和不回液现象的发生。在供体牛只采胚前20 min注射抗过敏药地赛米松等药品,避免上述症状的出现。

3.2 采卵管故障排除

选用质量过关的采卵管,固定气球时球的围度不要超过固定位置处子宫的围度,在倒角时尽量将采卵管撤出用大量生理盐水冲洗管内的粘液。将采卵管固定好之后第一次进液采用注射器推入法,用五十毫升注射器吸取20～30 mL冲卵液快速注入子宫内以其冲出采卵管内的粘液以便液体充分回流。

3.3 液体回流

气囊固定位置要准确,充气要适宜。若位置太靠后,则气囊封闭不住子宫角,冲卵时会发生丢水现象而回流不畅。如太靠前冲卵液不能完全冲回胚胎。采卵管气球围度依据子宫角粗细而定。气球过于膨胀易损伤子宫内膜,使其产生裂痕,冲卵液可渗透到粘膜固有层内。气球小则不能固定采卵管。如发现回液量小于进液量时应在进液时封闭子宫角尖端或是提高其位置,使得液体不外流。