HPLC法测定增液承气口服液中5种蒽醌类衍生物的含量

王爱英，王勤（1.甘肃张掖市人民医院，张掖市734000；2.甘肃张掖市食品药品检验所，张掖市734000）

增液承气口服液是在增液承气汤的基础上创制而成，由玄参、地黄、麦冬、大黄等4味中药材组成。增液承气汤出自清代医家吴鞠通《温病条辨·中焦篇》[1]，具有甘凉濡润、滋阴增液、软坚降泄、通腑泄热之功效，用于温病阳明腑实兼阴液亏损之证[2]。临床上主要用于治疗中老年习惯性便秘[3]、阴虚肠燥便秘[4]、慢性呼吸衰竭[5]、慢性支气管炎急性发作[6]、流行性出血热少尿期[7]等症，疗效确切。随着增液承气汤在临床上的广泛应用，为便于患者服用和携带方便，笔者将其研制开发为增液承气口服液，并采用高效液相色谱（HPLC）法对其中5种蒽醌类衍生物进行测定，以达到控制其内在质量的目的。

1 仪器与试药

Agilent1100型HPLC仪系统（美国Agilent公司）；Metler-D2025型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS3120A型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

芦荟大黄素对照品（批号：110795-201007，含量以98.0%计，以五氧化二磷为干燥剂干燥12 h后用）、大黄酸对照品（批号：110757-200206）、大黄素对照品（批号：110756-200110）、大黄酚对照品（批号：110796-201017）、大黄素甲醚对照品（批号：110758-201013）均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限责任公司）；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯；增液承气口服液（甘肃张掖市人民医院自制，批号：20100302、20100701、20100902、20100903、20101101）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 µL；以外标法定量。结果表明，阴性对照对含量测定无干扰；理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000。色谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备[8]

分别精密称取芦荟大黄素对照品8.38 mg、大黄酸对照品8.78 mg、大黄素对照品8.52 mg、大黄酚对照品8.70 mg、大黄素甲醚对照品4.78 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别制成每1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各约80 μg，大黄素甲醚约40 μg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各2 mL，混匀，即得混合对照品溶液（每1 mL含芦荟大黄素16.76 μg、大黄酸17.56 μg、大黄素17.04 μg、大黄酚17.40 μg、大黄素甲醚9.56 μg）。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品2 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，加8%盐酸溶液10 mL，超声（工作频率：40 kHz，功率：250 W）处理2 min，再加三氯甲烷15 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方制备工艺制成缺大黄的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，按上述色谱条件分别进样，测定。以对照品进样量（X，µg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得芦荟大黄素的回归方程为Y＝4 739.67X+3.28（r＝0.999 6，n＝5）、大黄酸的回归方程为Y＝3 959.48X+2.32（r＝0.999 8，n＝5）、大黄素的回归方程为Y＝3 200.47X+6.94（r＝0.999 9，n＝5）、大黄酚的回归方程为Y＝4 992.46X+32.29（r＝0.999 9，n＝5）、大黄素甲醚的回归方程为Y＝4 730.59X－1.71（r＝0.999 7，n＝5）。结果表明，5种成分进样量分别在0.067～0.335、0.070～0.351、0.068～0.341、0.070～0.348、0.038～0.191 µg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液适量，在上述色谱条件下连续进样6次，测定。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.36%、0.63%、0.95%、1.02%、1.81%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：20100902）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.10”项下方法测定。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为 0.56、0.44、0.81、0.35、0.27 mg·mL-1，RSD分别为1.29%、0.87%、0.54%、0.75%、1.88%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于0、4、8、12、24 h测定。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.54、0.44、0.82、0.37、0.26 mg·mL-1，RSD分别为1.13%、0.98%、0.91%、1.52%、1.97%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的同一批样品（批号：20100902）适量，共9份，每3份为一组，各加入一定量的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.10”项下方法测定样品含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery tests（n＝9）

续表1 Continued Tab1

2.10 样品含量测定

取5批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液适量，经0.45µm针筒过滤器过滤，精密吸取10µL进样，用峰面积按外标法计算样品中5种蒽醌类衍生物的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

在流动相的优化中，选用了乙腈、甲醇、磷酸系统的不同配比（80∶20、85∶15和88∶12）进行试验，结果随着乙腈、甲醇体积分数的增大，蒽醌类衍生物的保留时间相对减少；当以甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）为流动相时，能够获得较好的分离效果和较短的分离时间，理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000，所以选择此流动相系统作为本试验的流动相。

在选择检测波长时，从DAD检测器收集到的信息可知，蒽醌类衍生物在（225±2）、（254±2）、（428±2）nm波长处均有最大吸收，但从三维图谱结果来看，（254±2）nm波长处的响应值较其他两处大，故在上述色谱条件下确定254 nm为检测波长。

本试验测定结果表明，5批增液承气口服液中的5个指标性成分含量差异较大，这可能与原料的质量和生产工艺有关。根据单味药大黄的含量限度，结合本制剂中大黄所加量和制剂工艺，建议本品总蒽醌的含量限度为：本品每1 mL含大黄以5种蒽醌类衍生物的总量计，不得少于2.0 mg。

本试验建立的含量测定方法专属性强，经三氯甲烷提取后可排除其他非测定物质的干扰，测定结果准确，重复性好，可作为该制剂的质量控制手段。

[1]杨 进.温病条辨[M].北京：中国医药科技出版社，1996：201-207.

[2]杨端芬.增液承气汤治疗小儿病毒性肺炎88例[J].四川中医，2001，19（3）：60.

[3]牛桂珍.增液承气汤加减治疗中老年习惯性便秘的疗效观察[J].中国老年学杂志，2006，26（10）：1 432.

[4]沈雁鹏.增液承气汤治疗阴虚肠燥便秘证46例[J].中国民间疗法，2003，11（7）：40.

[5]肖阳娥，黄晓川.增液承气汤加减救治40例慢性呼吸衰竭临床观察[J].新中医，1997，29（3）：18.

[6]简小兵.增液承气汤治疗慢性支气管炎急性发作32例[J].山东中医杂志，2003，22（5）：65.

[7]韩英惠，杨运池.增液承气汤治疗流行性出血热少尿期40例[J].中国民间疗法，2002，10（5）：37.

[8]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：22.