美宝湿润烧伤膏对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的保护作用研究
2011-08-10张莉高志军赵静西藏大学医学院拉萨市850000西藏当雄县人民医院当雄县85500
张莉，高志军，赵静（.西藏大学医学院，拉萨市850000；.西藏当雄县人民医院，当雄县85500）
严重烧烫伤早期因肠黏膜屏障功能受损会导致肠道细菌和内毒素移位，激活炎症以及后续的代偿性抗炎反应和免疫系统自我保护作用，最终导致机体免疫失衡，从而引起全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），进而导致多器官功能障碍综合征（Multiple Organs Dysfunction syndrome，MODS）。国外研究证实，大鼠Toll样受体4（TLR4）信号通路及下游相关的效应分子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）参与了烧伤后炎症的发生[1]。有研究发现，作为TLR4的配体脂多糖（LPS）也在烧伤后续炎症反应中发挥着重要的作用[2，3]。
美宝湿润烧伤膏（MEBO）主要成分包括黄连、黄柏、黄芩、地龙、罂粟壳，具有清热、解毒、止痛、生肌功效，广泛用于治疗各种烧、烫、灼伤。在本研究中，笔者将MEBO运用于烫伤大鼠，观察其对烫伤大鼠创面愈合和TLR4/LPS信号通路及TNF-α、IL-6的影响，初步阐明其对烫伤后炎症的相关作用机制，为烧烫伤创面愈合的临床治疗提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）；680型全波长酶标检测仪（美国Bio-Rad公司）；721型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；内毒素检测试剂（鲎试剂）动态检测仪（北京时代新光生物技术有限公司）。
1.2 试药
MEBO（汕头市美宝制药有限公司，批号：Z20000004）；鲎试剂（上海坤肯生物化工有限公司）；PE标记的大鼠TLR4单克隆抗体、FITC标记的鼠免疫球蛋白G（IgG）均购自美国BD公司；红细胞裂解液、TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒（深圳晶美生物技术公司）。
1.3 动物
大鼠30只，♂，体重280～320 g，由第三军医大学实验动物中心提供（动物合格证号：24301050）。
2 方法
2.1 模型的复制和分组、给药
将30只SD大鼠随机均分为空白对照、模型对照和MEBO组。除空白对照组外，其它大鼠在清醒状态下，以200 g·L-1硫化钠背部脱毛；200 g·L-1的乌拉坦溶液按5 mL·kg-1ip麻醉，置电热恒浴中致背部烫伤（108℃，8 s），复制深Ⅱ度（经病理证实）烫伤模型，烫伤后ip生理盐水（40 mL·kg-1）抗休克。创面处理方式：模型对照组大鼠烫伤后让创面暴露；MEBO组大鼠烫伤后涂MEBO于创面（厚度薄于1 mm），每8 h更换新药。注意换药前需将残留在创面上的药物及液化物拭去，同时暴露创面。烫伤后大鼠分笼饲养。观察期间未发生明显感染症状。
2.2 标本收集
将空白对照和MEBO组大鼠在烫伤后各时相点麻醉，无菌条件下经尾静脉采集静脉血，一部分置于去热源肝素化试管中，3 000 r·min-1、4℃下收集血浆；一部分置于去内毒素的干净试管中自凝，3 000 r·min-1、4℃下收集血清。样本于－70℃贮藏，备用。
2.3 大鼠创面愈合情况观察
每日观察伤口愈合情况，以创面完全上皮化、无渗出作为创面完全愈合依据，同时记录创面愈合时间；按Nagelschmidt法[6]计算各时相点创面愈合率：用透明称量纸（7.5 cm×7.5 cm，平均重量约为0.156 8 g）覆盖于大鼠背部创面，将创面边缘清晰描绘在透明称量纸上，仅保留曲线绘制所围的面积并称重。创面面积＝（7.5 cm×7.5 cm×纸片重）/0.156 8 g；创面愈合率/%＝（原始创面面积－未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。
2.4 LPS检测
参考鲎试剂检测说明书，采用浊度法（内毒素检测法）检测各组大鼠血浆中内毒素含量。其原理是当被检测的样品中含有内毒素时，鲎试剂会变混浊。内毒素含量与混浊程度呈正比，可准确量化被检测样品中内毒素的含量。显色后采用分光光度计于540 nm波长处测定吸光度值。根据标准曲线求得大鼠血浆中LPS含量。
2.5 ELISA检测
采用ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-6的表达水平，按说明书进行操作。
2.6 流式细胞术检测
抽取EDTA抗凝静脉血2 mL，采用细胞分离柱方法进行，在无菌情况下采用淋巴细胞分离液方法分离淋巴细胞，荧光抗体标记的淋巴细胞悬液4℃条件下避光孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min。取1×106个·mL-1细胞标记的抗TLR4-PE单克隆抗体和抗FITC-IgG单克隆抗体，上流式细胞仪进行检测。
2.7 统计学方法
所有计量资料均采用±s表示；TNF-α含量、IL-6含量用χ2检验行统计学分析；LPS含量用t检验及单因素方差分析。采用SPSS 11.0软件进行统计，P＜0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 各组大鼠创面愈合时间及不同时相点创面愈合率
相对于模型对照组[（22.83±2.82）d]，MEBO组大鼠创面愈合时间[（17.25±1.78）d]显著缩短（P＜0.01）。各组大鼠创面愈合时间见表1。
表1 各组大鼠创面愈合时间（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）
表1 各组大鼠创面愈合时间（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.01
创面愈合时间/d 22.83±2.82 17.25±1.78＊组别模型对照组MEBO组
在伤后的前3天，MEBO组大鼠与模型对照组比较，创面愈合率无显著差异（P＞0.05）；从第7天至第21天，MEBO可明显促进烫伤大鼠的创面愈合（P＜0.01或P＜0.05）。不同时相点各组大鼠创面愈合率见表2。
3.2 各组大鼠血浆中LPS含量变化
表2 不同时相点各组大鼠创面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）
表2 不同时相点各组大鼠创面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
组别模型对照组MEBO组不同时相点的愈合率/%28 d 100 100 1 d 2.03±0.32 1.98±0.30 3 d 10.69±2.32 11.84±3.89 7 d 36.87±6.25 41.88±8.03＊14 d 70.56±12.20 85.46±13.74＊＊21 d 92.07±14.64 100＊＊
伤后第1天至第7天，模型对照组大鼠血浆中LPS含量逐渐升高，于第7天达到顶峰后逐渐降低；与模型对照组比较，从第7天至第21天，不同时相点MEBO可显著降低烫伤大鼠血浆中LPS含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同时相点各组大鼠血浆LPS含量变化见表3。
3.3 伤后各组大鼠血清中TNF-α和IL-6含量变化
表3 不同时相点各组大鼠血浆LPS含量变化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
表3 不同时相点各组大鼠血浆LPS含量变化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
组别模型对照组MEBO组不同时相点的LPS含量/μg·mL-1 28 d 0.73±0.17 0.69±0.18 1 d 0.70±0.11 0.73±0.10 3 d 0.72±0.14 0.69±0.12 7 d 1.23±0.34 0.91±0.26＊＊14 d 0.98±0.22 0.76±0.19＊＊21 d 0.85±0.18 0.71±0.16＊
第1天至第28天，模型对照组大鼠血清中TNF-α的水平逐渐降低；与模型对照组比较，从第7天至第28天，MEBO可有效降低烫伤模型大鼠血浆中TNF-α含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同时相点各组大鼠血清TNF-α含量变化见表4。
表4 不同时相点各组大鼠血清TNF-α含量变化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
表4 不同时相点各组大鼠血清TNF-α含量变化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
模型对照组MEBO组0.56±0.19 0.43±0.13＊＊1.38±0.35 1.43±0.38 0.98±0.27 0.93±0.26 0.78±0.18 0.61±0.20＊0.70±0.22 0.58±0.18＊0.63±0.21 0.51±0.16＊＊
模型对照组大鼠血清中IL-6于第3天达到最高峰，随后缓慢下降；经MEBO处理后，大鼠血清中IL-6的表达水平于第7天开始显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同时相点各组大鼠血清IL-6含量变化见表5。
表5 不同时相点各组大鼠血清IL-6含量变化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）
表5 不同时相点各组大鼠血清IL-6含量变化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
模型对照组MEBO组110.00±21.44 108.41±21.96 105.33±20.63 104.01±21.63 143.45±23.26 145.54±22.90 135.69±21.77 128.95±20.10＊123.33±20.47 117.63±19.92＊118.88±20.85 109.79±18.64＊＊
3.4 各组大鼠外周血中TLR4百分率变化
模型对照组大鼠外周血中TLR4百分率逐渐升高，第14天达到最高峰，随后缓慢下降；与模型对照组比较，MEBO组大鼠外周血中TLR4百分率于第7天开始显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同时相点各组大鼠血浆中TLR4百分率变化见表6。
表6 不同时相点各组大鼠血浆中TLR4百分率变化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
表6 不同时相点各组大鼠血浆中TLR4百分率变化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）
与模型对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
组别模型对照组MEBO组不同时相点的TLR4百分率/%1 d 1.70±0.24 1.72±0.22 3 d 2.80±0.33 2.78±0.30 7 d 5.58±0.57 4.65±0.43＊14 d 7.58±0.69 6.08±0.53＊＊21 d 5.96±0.94 5.19±0.81＊28 d 3.68±0.35 3.30±0.38
4 讨论
烧、烫伤后各种炎症细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6大量释放，从而引发和加重全身炎症反应[4，5]。近来研究发现，TLR4/LPS信号通路参与了烧伤后全身炎症的发生[1]。
TLR家族是模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）中的一大类。TLR在人类进化过程中保持高度保守的分子适应性免疫，能识别细菌、真菌、病毒，还包括疟原虫等寄生虫[6]。这种受体最早在果蝇体内发现，对果蝇的天然免疫起重要作用，后来在哺乳动物的体内陆续发现了这类Toll受体，它们参与、介导了LPS等相关分子模式诱发的先天免疫，目前已发现的TLR有13种（TLR1-13）[7]。
TLR4是第一个被鉴定的人类Toll样受体，是机体识别细菌LPS的模式识别受体。TLR4与LPS相互作用的机制目前认为：LPS与单个核细胞膜上的脂多糖结合蛋白（LPS binding protein，LBP）结合；同时，Toll/IL-1受体家族胞浆区的接合蛋白——髓样分化蛋白（Myeloid ifferentiation protein 88，MyD88）分子通过与TLR的相互作用形成复合物，再通过MyD88分子中的死亡结构域的同嗜作用募集IRAK（IL-1 receptor-associated kinase）与肿瘤坏死因子相关因子TRAT6（Tummor necrosis factor-associated factor 6）等信号途径，激活核因子-κB（NF-κB），活化AP-1等转录因子，从而调节TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子、黏附分子和炎症因子的转录表达，进而影响免疫与炎症反应[8]。
在与烧伤相关的研究中傅颖珺等[9]发现，严重烧伤时大鼠脾脏TLR4 mRNA和蛋白水平以及早期的致炎细胞因子水平均明显升高；同时研究还发现，严重烧伤时TLR4的上调可能是通过调节性T细胞来实现的。在本研究中笔者同样发现，烫伤后第14天开始大鼠TLR4的表达水平明显升高，其结果与王明青等[10]的研究基本一致。而经过EMBO处理后，TLR4在烫伤大鼠外周血中的阳性表达率明显下调。
MEBO作为一种有效的烧伤治疗药物，广泛用于各种烧、烫、灼伤。本研究中，笔者以MEBO运用于烫伤大鼠，发现MEBO可有效缩短烫伤创面愈合时间并促进烫伤创面的愈合。笔者同样观察了烫伤大鼠血清中TLR4/LPS信号通路下游的效应分子TNF-α和IL-6的表达水平。结果发现，烫伤后第1天至第28天，模型对照组大鼠血清中TNF-α的水平逐渐降低，其结果与现有报道存在一定的差异。作为炎症早期的致炎细胞因子，烫伤后TNF-α表达水平在24 h内迅速升高，随后逐渐降低。而在本研究中，由于没有设定烫伤后更早的时相点，故没有观察到TNF-α在烫伤后24 h内迅速上升的趋势。IL-6作为炎症中晚期出现上升趋势的细胞因子，笔者观察到烫伤后第3天IL-6升到最高峰，随后缓慢下降。而经过MEBO处理后，与模型对照组比较，大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明显降低，提示MEBO具有对TNF-α和IL-6的有效抑制效应。
在本研究中，笔者证实了MEBO对于烫伤创面愈合的促进作用，初步阐明了其作用机制可能与抑制TLR4/LPS信号通路及下游的致炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达有关。但是，MEBO是如何调控TLR4/LPS信号通路中的调节分子从而促进烫伤创面愈合的，需要进一步研究。
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