低温诱导青蒿素生物合成Δ

杨瑞仪，卢元媛，杨雪芹，冯丽玲，曾庆平（广州中医药大学热带医学研究所，广州市 510405）

青蒿素是20世纪70年代由我国科学家根据古籍记载及民间验方首先从中草药黄花蒿Artemisia annuaL.中发现并率先应用的抗疟药。由于其安全性、有效性和速效性，以青蒿素为基础的联合治疗方案被世界卫生组织推荐在世界各大主要疟疾流行区推广应用。除此以外，青蒿素类药对于其他传染病（如血吸虫病、乙型肝炎等）和癌症[1]也具有一定的疗效。因此，青蒿素的药用价值非常大。黄花蒿是目前发现的唯一能合成青蒿素的天然植物，但产量很低，仅为0.01%～0.8%左右。有观点认为，在双氢青蒿酸前体向青蒿素转化的过程中，青蒿素发挥着活性氧（Reactive oxygen species，ROS）自由基储备池的作用，其独特的过氧桥结构被认为是双氢青蒿酸淬灭ROS生成氢过氧化物中间体后产生的最终产物[2]。Wallaart TE等[3]发现，经过夜霜季节后，青蒿素含量升高并伴随着双氢青蒿酸的下降，推测霜冻可能作为一种压力条件启动了双氢青蒿酸向青蒿素的转化。在环境胁迫（冷、热、强光、干旱、盐碱等）下，植物中由ROS造成的氧化胁迫是一种普遍现象。虽然氧化胁迫诱导植物次生代谢产物合成的研究已先后在人参、红豆杉、丹参、长春花中报道，但关于氧化胁迫与青蒿素合成之间相互关系的研究相对较少。本研究以低温为胁迫条件，研究其对黄花蒿氧化还原状态及青蒿素合成的影响。

1 仪器与试药

P680型高效液相色谱仪（美国Dionex公司）；Ultrospec 3300pro型紫外-可见光分光光度计（美国GE公司）；ABI7300型实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；SPX-250B-G型微电脑光照培养箱（上海博迅实业有限公司）。

黄花蒿种子（重庆酉阳，华阳2号）由广州中医药大学青蒿研究中心鉴定为真品，广州中医药大学热带医学研究所保存；青蒿素标准品（批号：13806ED）、组氨酸（批号：423834）均购自美国Sigma-Aldrich公司；N，N-二甲基-对-亚硝基苯胺（日本东京化成工业株式会社，批号：3Q58C）；RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）；RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Fermentas中国公司）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本Toyobo公司）；引物由美国Invitrogen中国总公司合成；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 植物培养及低温处理

黄花蒿种子用70%乙醇浸润30 s，3%NaOCl浸泡30 min，无菌水漂洗4～5次，均匀散播在1/2 Murashige and Skoog（1/2MS）培养基润湿的滤纸上避光发芽。种子发芽后移至含0.8%琼脂的1/2MS固体培养基上，25℃光照培养（光周期：16 h光/8 h暗）。种子发芽30 d后，选取长势均一的无菌苗移至4℃光照培养箱进行低温处理（光周期：16 h光/8 h暗）。

2.2 统计学方法

试验中每个指标的测定均重复6个样本（n＝6），每个样本测定均重复3次。数据采用SPSS 13.0软件进行统计，采用配对t检验进行显著性分析。

2.3 低温对青蒿素合成的影响

青蒿素含量测定：叶片于50℃烘箱中烘24 h，烘干后研成细粉，过筛，精确称取0.100 g，置于10 mL容量瓶中，加入丙酮10 mL，超声波提取30 min，用丙酮补足至10 mL。提取液过滤后进样检测。同时，精确称取青蒿素标准品0.010 g，加入甲醇溶解配成浓度为0.298 mg·mL-1的溶液，分别取6、10、14、20、30 μL进样，制备标准曲线。色谱条件：色谱柱为Phenomenex BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（48∶52，V/V），流速为1 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为216 nm。以每1 g干重叶片所含青蒿素量来表示青蒿素含量，单位为mg·g-1。

与25℃比较，经过4℃低温处理4 h后，青蒿素含量开始上升（P＜0.05），24 h后上升幅度加大（P＜0.01）。冷刺激4、24和48 h后青蒿素含量分别提高20%、65%和80%。4℃处理对青蒿素合成的影响见图1。

2.4 低温对黄花蒿单线态氧（1O2）和过氧化氢（H2O2）生成的影响

图1 4℃处理对青蒿素合成的影响（n＝6）与25 ℃对照比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 Effects of 4℃treatment on the biosynthesis of artemisini（nn＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

H2O2的测定参照硫酸钛沉淀法[4]，以每1 g鲜重叶片中所含H2O2量来表示H2O2浓度，单位为μmol·g-1。1O2的检测参照文献[5]，反应液中加入有颜色的N，N-二甲基-对-亚硝基苯胺作为1O2的吸收剂，通过N，N-二甲基-对-亚硝基苯胺的漂白反应（吸光度（OD）值下降）来检测1O2的生成。具体来说，5 mL反应液（45 mmol·L-1pH7.1 PBS、10 mmol·L-1组氨酸、50 μmol·L-1N，N-二甲基-对-亚硝基苯胺）中加入150 mg剪碎的叶片，空白对照不加叶片。光照（3 000 lx）下反应1 h，反应液10倍稀释后读取440 nm波长处的OD值。按下式计算低温处理相对于对照条件（25℃）1O2的生成率：[（OD440（空白）－OD440（4℃））/（OD440（空白）－OD440（25℃））]×100%。

在4℃处理过程中，黄花蒿叶片1O2和H2O2的含量都是先升高后降低，在4 h后即达到最大值。以1O2相对生成率（4℃/25℃）来表示低温处理下1O2的生成变化，处理4 h后1O2上升1倍，随后下降，在24和48 h分别比对照高40%和30%；H2O2含量在4 h时为对照的1.6倍，并维持至24 h，处理48 h后，H2O2含量回落至略高于对照水平。4℃处理对1O2生成率的影响见图2；4℃处理对H2O2生成量的影响见图3。

图2 4℃处理对1O2生成率的影响（n＝6）与0 h比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 2Effects of 4℃treatment on the1O2productio（nn＝6）vs.0 h：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.5 低温对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

CAT活性测定参照文献[6]，精确称取0.500 g叶片，加入少量石英砂、2 mL 2%聚乙烯吡咯烷酮、100 mg CaCO3，冰浴研磨成匀浆，4 ℃12 000 r·min-1离心 5 min，取上清加入 50 mmol·L-1pH7.0的PBS定容至10 mL，此为CAT粗酶提取液。取10倍稀释的CAT粗酶提取液1.00 mL，加入10 mmol·L-1H2O22.00 mL，迅速混匀，5 min内连续读取波长240 nm处的OD值，计算每分钟的OD值变化（ΔOD240）。以1.00 mL 10倍稀释的CAT粗酶提取液与2.00 mL H2O的混合液为空白对照。用每1 g鲜重叶片每1 min催化H2O2分解的量来表示CAT活性，单位为μmol·min-1·g-1。

与25℃对照比较，CAT活性在4℃处理4 h后提高了2.2倍，并进一步升高，在24 h达到最大值，为对照的5.3倍。48 h后CAT活性有所下降，但维持在对照的2.8倍水平。4℃处理对CAT活性的影响见图4。

图3 4℃处理对H2O2生成量的影响（n＝6）与25℃对照比较：＊P＜0.05Fig3 Effects of 4℃treatment on the production of H2O2（n＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05

图4 4℃处理对CAT活性的影响（n＝6）与25 ℃对照比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig4 Effects of 4 ℃ treatment on activities of CAT（n＝6）vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.6 低温对黄花蒿基因表达的影响

2.6.1 实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR） 取叶片100 mg，按照RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。取1 μg 总RNA，按照RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行逆转录反应，合成cDNA。以10倍稀释的cDNA为模板与SYBR Green Realtime PCR Master Mix混合，RTFQ-PCR反应在ABI7300实时荧光定量PCR仪上进行。定量PCR引物见表1（以actin基因为内参，基因的相对转录水平＝基因mRNA拷贝数/actin mRNA拷贝数）。

表1 定量PCR引物Tab1 Primers for real time fluorescence quantitative PCR

2.6.2 低温对青蒿素生物合成基因表达的影响 经过4℃低温处理24 h后，青蒿素合成相关基因[3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR）、法呢基焦磷酸合酶基因（FPS）、紫穗槐二烯合酶基因（ADS）、细胞色素P450单加氧酶基因（CYP71AV1）、细胞色素P450氧化还原酶基因（CPR）和青蒿醛Δ11（13）双键还原酶基因（DBR2）]的表达都普遍上调。其中ADS和HMGR的上调幅度较大，转录水平比对照增加16倍和3.2倍。其余基因CYP71AV1、DBR2、CPR与FPS的mRNA水平分别为对照的2.8、2.5、1.9与1.5倍。4℃处理对青蒿素生物合成基因表达的影响见表2。

2.6.3 低温对其他萜类合成基因表达的影响 在黄花蒿中，法呢基焦磷酸（FPP）是萜类合成的一个重要的分支起点，除紫穗槐二烯合酶（ADS）以此为底物开始青蒿素合成外，同样以FPP为底物的萜类合酶还有合成鲨烯的鲨烯合酶（SQS）、合成β-石竹烯的β-石竹烯合酶（CS）、合成（E）-β-法呢烯的（E）-β-法呢烯合酶（FS）以及合成表柏木脑和柏木脑的柏木脑合酶（EPS）等。经过4℃低温处理24 h后，ADS基因表达大幅上调的同时，各竞争途径的萜类合酶基因的表达在低温诱导条件下也呈现不同的变化。SQS和FS基因对低温诱导无应答，诱导前后表达水平无明显差异，而EPS基因的表达提高3倍，CS基因的表达则显著下降近20倍。4℃处理对青蒿萜类合成基因表达的影响见表3。

表2 4℃处理对青蒿素生物合成基因表达的影响（±s，n＝6）Tab2 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of artemisinin biosynthetic gene（±s，n＝6）

表2 4℃处理对青蒿素生物合成基因表达的影响（±s，n＝6）Tab2 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of artemisinin biosynthetic gene（±s，n＝6）

与25 ℃对照比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.25 ℃ controls：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

温度/℃25 4基因mRNA拷贝数/actin mRNA拷贝数DBR2 2.05±0.33 5.04±1.68＊＊HMGR 0.08±0.03 0.35±0.03＊＊FPS 0.11±0.02 0.28±0.18＊ADS 0.17±0.04 2.92±0.19＊＊CYP71AV1 0.05±0.02 0.13±0.03＊＊CPR 1.58±0.25 2.95±0.29＊＊

表3 4℃处理对青蒿萜类合成基因表达的影响（±s，n＝6）Tab3 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of terpenoids biosynthetic gene（±s，n＝6）

表3 4℃处理对青蒿萜类合成基因表达的影响（±s，n＝6）Tab3 Effects of 4℃treatment on transcriptional expressions of terpenoids biosynthetic gene（±s，n＝6）

与25℃对照比较：＊P＜0.01vs.25 ℃ controls：＊P＜0.01

温度/℃25 4基因mRNA拷贝数/actin mRNA拷贝数EPS 0.31±0.14 1.21±0.39＊SQS 0.51±0.06 0.54±0.18 CS 0.68±0.19 0.03±0.01＊FS 0.29±0.05 0.32±0.05

3 讨论

植物的大多数生理生化过程都有ROS的产生。一般认为ROS是一种有害的氧代谢中间物，是引起细胞结构和功能损伤的主要因素；但同时ROS也是一种普遍存在的信号分子，参与植物的防御反应、基因表达调控等。Wallaart TE等[2，7]从黄花蒿中检测到双氢青蒿酸及其氢过氧化物，首次提出双氢青蒿酸可能充当ROS清除剂的假设，并认为双氢青蒿酸可能通过参与氧自由基催化的非酶促反应转化成青蒿素。双氢青蒿酸等青蒿素合成前体在黄花蒿中的含量相对较为丰富，但进一步的过氧化反应似乎成为青蒿素合成的瓶颈，而1O2等ROS在此过程中起重要作用。有研究发现，在黄花蒿褐变的老叶中检测到1O2浓度暴发式增长，同时青蒿素前体转化成青蒿素的速度加快，青蒿素产量提高[8，9]。一些人工模拟的胁迫条件，如高浓度盐和重金属[10]、寡糖诱激子[11]等也同样可以通过促进ROS生成而有利于青蒿素的积累。在本研究中，经过4℃低温处理后，黄花蒿中1O2和H2O2浓度逐渐上升，但48 h后伴随着CAT活性和青蒿素含量的提高，浓度开始下降。Pu GB等[4]用水杨酸处理黄花蒿发现H2O2和超氧阴离子浓度在4 h迅速升高，促使双氢青蒿酸向青蒿素转化，而后随着青蒿素含量的逐渐上升而逐步下降，与本研究结果相符，揭示ROS可能作为信号分子促进青蒿素的转化。

另外，本研究还发现经过低温处理后青蒿素合成相关基因的表达普遍上调，尤其是编码青蒿素特异合成途径的第一个关键限速酶——ADS的基因表达上升幅度最大。本课题组在以往的研究中也发现4℃处理黄花蒿苗30 min后，ADS、CYP71AV1和CPR的表达量上调，但上调幅度不如作用24 h高[12]。在蛋白表达水平上也证实，经过冷诱导后，ADS与CYP71AV1这两个酶的浓度分别上升50%和80%[13]。用水杨酸处理黄花蒿同样也可见ADS和HMGR表达量提高，而青蒿酸、双氢青蒿酸和青蒿素含量也相应提高[4]。可见，低温胁迫可通过直接诱导青蒿素合成相关基因表达而促进青蒿素合成。在黄花蒿中，以FPP为底物可以在不同的萜类合酶的作用下开始不同的萜类合成，调控这些萜类合酶的表达，比如过量表达ADS基因，同时抑制与青蒿素合成竞争底物的酶的基因表达，这对于增加青蒿素生物合成途径的代谢流量、促进青蒿素合成有积极的意义。本课题组利用农杆菌介导的基因转化法将反义SQS整合于黄花蒿基因组，通过表达反义SQS来阻遏SQS表达，减少类固醇合成途径对底物FPP的竞争性利用，获得了高产青蒿素的转基因株，其SQS表达水平最高下降90%，ADS表达水平为原来的3倍，表明在压力作用下萜类合成的代谢流量会发生变化[14]。本研究发现，低温条件一方面可促进青蒿素合成途径ADS的表达；另一方面可抑制青蒿素合成竞争途径CS基因的表达，以改变代谢流方向。

综上，短暂的低温刺激可能通过以下途径提高青蒿素的合成：（1）产生高浓度ROS促进青蒿素合成前体的转化；（2）诱导青蒿素合成相关基因尤其是特异酶基因表达，促进青蒿素前体合成；（3）刺激青蒿素生物合成途径，抑制竞争途径，藉此增加青蒿素合成途径的代谢流量。本研究结果对于今后利用氧化胁迫条件提高青蒿素产量有重要意义。

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