豫北地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定与耐药性检测

王丽荣,董永军,刘兴友,邓广付,赵德明

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.河南科技学院动物科学学院动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南 新乡 453003)

副猪嗜血杆菌(Hps)是副猪嗜血杆菌病的病原菌,引起猪的浆液性、化脓性、多发性浆膜炎,影响2周龄到4月龄的猪,主要在断奶后和保育阶段发病,通常见于5～8周龄的猪,发病率一般在10%～15%,严重时死亡率可达50%。随着我国规模化、集约化猪场的发展,副猪嗜血杆菌病在我国出现流行趋势,发病率和死亡率均呈上升趋势,即使能耐过,也会造成仔猪生长发育不良,造成严重的经济损失。

自2009年11月以来,豫北地区几个市多家猪场仔猪、育肥猪发生精神沉郁,食欲废绝,体温高达41℃,呼吸急促;部分病例体温稍有升高,咳嗽,腹式呼吸,拉稀,逐渐减食,消瘦。剖检可见猪胸腔内、心包膜内均有多量纤维素性渗出物;肺脏病变尤其明显,除表面覆有大量纤维素性渗出物外,还有多处结缔组织包围的小化脓灶,全肺出血;全身淋巴结肿大,切面呈大理石花纹样;肾、十二直肠均有出血点,回盲口附近有扣状溃疡,脾脏出血性梗死;患病猪经药物治疗效果不明显,费用大,猪伤亡较大。而且近一年来该病例在豫北地区发生频繁,给当地养猪业带来了较大的损失。

鉴于此,笔者对豫北地区几个市多家猪场发生仔猪、育肥猪疑似副猪嗜血杆菌病的病例进行了病原的分离鉴定和耐药性测定,为临床防治该病提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 病料 豫北地区新乡市、安阳市、焦作市、濮阳市等多家猪场进行采样。

1.2 培养基 常规方法配制营养琼脂后按8%加入新鲜绵羊血,按1%加入过滤除菌的0.01%NAD制成;胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)固体培养基:常规配制TSA固体培养基按5%加入过滤除菌的牛血清,按1%加入过滤除菌的0.01%NAD制成。

1.3 生化试验试剂 氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、硝酸盐、蔗糖、脲酶等,均购自杭州天和微生物试剂有限公司,批号:200907;新生胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,批号:200904;NAD购自上海生工生物工程技术服务有限公司,批号:200906。

1.4 药敏试纸 复方新诺明、新霉素、庆大霉素、环丙沙星 、链霉素、土霉素、四环素、林可霉素等试纸均购自杭州微生物试剂有限公司,批号:200909。

1.5 方法

1.5.1 触片镜检 无菌采取病猪的心血、胸膜腔积水、心包积液、关节积液直接涂片,采取肺、肝、肾、淋巴结触片,染色镜检。

1.5.2 细菌分离培养及培养特性检查 无菌采取肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料,分别接种于巧克力琼脂平板,对疑似Hps的菌落接种到TSA平板上纯化培养。将分离的细菌分别接种于普通琼脂培养基、血琼脂平板各2份(各取1份置于5%～10%CO2中培养)。

1.5.3 V因子需要试验 将分离的细菌分别接种于巧克力琼脂培养基,培养24～48 h。

1.5.4 卫星现象检查 将鲜血琼脂平皿分为两部分,分别接种所分离的细菌。在其中一部分划线接种金黄色葡萄球菌,培养24～48 h。

1.5.5 疑似菌株生化鉴定 无菌挑取纯化菌落,接种于无NAD的鲜血琼脂平板上,再垂直划线接种金黄色葡萄球菌,37℃培养24～48 h,观察是否有“卫星现象”和溶血现象,取具有“卫星现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于脲酶、氧化酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微量生化鉴定管(微量生化鉴定管中同时加入5μL 0.01%NAD及5μL新生胎牛血清),观察并记录结果。

1.5.6 药敏试验 无菌棉签蘸取分离菌的肉汤培养物,涂布接种于巧克力琼脂平板,待稍干燥后,用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面,37℃培养20～24 h后,观察测定抑菌环的大小。

判定标准:抑菌环直径在15 mm以上的为高度敏感 ;10～15 mm为中度敏感;10 mm以下为低度敏感;无抑菌环的为不敏感。

2 结果

2.1 染色镜检 对不同组织、部位所取的病料,经染色后均见到革兰阴性的细小杆菌。菌体形态多样,以纤细杆状者居多,间有长而弯曲丝状菌体,个别呈两极浓染的球杆状。

2.2 分离培养结果 病料接种于巧克力培养基上培养 24～48 h后生长良好,形成针尖大小、圆形、半透明、光滑湿润的菌落;在普通肉汤和营养琼脂,37℃培养24 h后,未见细菌生长;在血平板上培养48 h,可见有针尖大小、圆形、边缘整齐、灰白色半透明的小菌落生长,不表现溶血现象;其中以5%～10%CO2培养的菌落较多,涂片镜检,形态和染色特征与直接涂片一致。

2.3 生长因子需要试验 分离菌在 TSA(含NAD)平板,置37℃,5%CO2培养箱培养48 h,出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小菌落,镜检可见大小不一,形态有细长、丝状、球杆状的革兰阴性杆菌,符合副猪嗜血杆菌的形态和染色特征;接种无NAD的TSA不生长。

2.4 卫星现象检查 接种血琼脂平板分离菌在金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长,距金黄色葡萄球菌愈近菌落越大,愈远菌落较小,呈现出明显的“卫星现象”;而在未接种金黄色葡萄球菌的另半部分则生长不良,菌落稀少,不见“卫星现象”。

2.5 生化试验结果 见表1。

从表1可得:分离菌发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖;硝酸盐阳性;氧化酶、吲哚、尿酶阴性,该结果符合副猪嗜血杆菌的生化特性。

2.6 药敏试验结果 见表2。

由表2可见,23株分离株对药物呈现不同的敏感性,有10株对四环素、4株对链霉素高度敏感;有10～20株对新霉素、庆大霉素、林可霉素中度敏感;有6～15株对环丙沙星、复方新诺明、土霉素耐药;而且分离菌株有多株出现多重耐药性。

表1 分离菌株生化试验

表2 分离菌株药敏试验 (抑菌环直径:mm)

3 讨论与小结

近年来,由副猪嗜血杆菌引起的猪群多发性浆膜炎和关节炎等在我国常有发生,且多发于春冬气候骤变季节,给规模化猪场造成的经济损失较大。副猪嗜血杆菌在病料中的分离率比较低,一般患病猪死亡12 h后,在病料中几乎分离不到,因此需在患猪剖杀或死亡12 h内及时进行病原分离,而且其对营养要求苛刻,其在巧克力培养基上培养48 h生长也较差。一般该菌的分离应采用含NAD、酵母浸出液和10%马血清的TSA培养基。通过对豫北地区患病猪进行病原菌的分离鉴定、生化试验,得到了23株副猪嗜血杆菌,对分离菌株进行药敏试验,结果显示该地区流行株严重多重耐药,部分菌株对环丙沙星、四环素高度敏感;6～15株对环丙沙星、复方新若明、土霉素耐药;而且分离菌株有多株出现多重耐药性,这也与该病原菌水平传播和克隆传播有关。

猪副嗜血杆菌在一个猪场中经常存在几个菌株或几个血清型的情况,给疫苗免疫带来困难;而且耐药性产生速度较快,药物治疗效果不稳定,故临床应根据分离菌株药敏试验结果进行合理科学的用药,防止该菌耐药性的发生及有效治疗。

[1]蔡旭旺,刘正飞,陈焕春,等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报,2005,24(1):55-58.

[2]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:120-126.

[3]尹秀凤,姜平,邓雨修,等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[J].畜牧与兽医,2004,36(7):6-8.

[4]Oliveira S,Galin a L,Pijoan C.Development of a PCR test to diag-nose Haemophilu s parasuis infections[J].J Vet Diagn Invest,2001,3(6):495-501.

[5]Puen te Red ond oV A,Navas Mendez J,Garciadel Blanco N,et al.T ypingm of Haem op hilus parasuisstrains by PCR-RFLP analy sis of the tbpA gene[J].Vet Microbio,2003,92(3):253-262.

[6]S egales J,Doming o M,Solano G I,et al.Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus and Haem ophilu sparasuisantigen distribu tion in dually infected pigs[J].Vet Microbio,1999,64(4):287-297.