4种商品化试剂盒检测猪瘟病毒抗体的比较分析

庞 然,张小敏,周 斌,何丹妮,陈溥言

(南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏 南京 210095)

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性、高度致死性传染病,是严重影响养猪业发展的主要疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类l6种传染病之一,我国亦将其列为一类传染病,是发生最多、危害最大、流行最广的动物传染病之一。由于长期贯彻预防为主的指导思想,坚持广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗的防治措施,该病在我国已经得到有效控制,大规模的暴发流行基本停止[1]。2009年,一些猪场发生典型的猪瘟,给猪场造成了极大的经济损失[2],致使许多兽医工作者和养猪业主对我国猪瘟疫苗的免疫效果产生了怀疑,从而给我国猪瘟的防制工作带来新的问题。

按照农业部《高致病性禽流感、口蹄疫等重大动物疫病免疫方案》和省属要求,猪瘟免疫抗体检测采用正向间接血凝试验(IHA)或者酶联免疫吸附试验(ELISA)2种方法。ELISA是应用最广,发展最快的一项新技术,其基本过程是将抗体(或抗原)吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶反应,底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果[3]。ELISA有间接法、夹心法、竞争法和阻断ELISA等。然而目前国内对猪瘟抗体的检测方法较多,主要 IHA、Dot-ELISA和猪瘟抗体免疫金标试纸,在实际检测工作开展中常会碰到一些问题,而且不同检测能力水平对检测结果有所影响,检测操作技能要求高的试验方法难以在基层推广应用,为提高检测结果准确性,结合操作技能要求,我们选择了4种商品化的猪瘟抗体检测试剂盒进行了比对试验,将试验结果作一分析总结如下,供同行参考。

1 材料与方法

1.1 检测试剂盒 (1)IHA试剂盒:中国农业科学院兰州兽医研究所生产,批号:100314。(2)进口阻断ELISA试剂盒:美国IDEXX公司生产,批号:99-43220S671。(3)进口阻断ELISA试剂盒:法国LSI公司生产,批号:9F2F。(4)进口阻断试剂盒:韩国JBT公司生产,批号:107304SD15。

1.2 试验血清 根据猪的日龄选取免疫背景清楚的血清共70份,且该70份血清已经经过中和试验检测。其中母猪10份,60日龄猪16份,100日龄猪10份,后备种猪34份。

1.3 检测 检测试剂盒均在有效期内,检测操作按盒内说明书进行,各试剂检测对照均成立,检测结果按试剂盒要求判定。

1.4 检测数据处理分析 以中和试验数据为标准,计算4种试剂盒的检测结果值相对中和试验检测结果值的特异性、敏感性和结果符合率,以期得出相对稳定和符合率高的试剂盒,以有利于临床的检测和指导。

1.5 中和试验检测临床70份血清 采用荧光抗体染色法进行中和试验,方法如下:将CSF阳性、阴性血清及待检血清按 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释。每份待检血清设4个重复,将CSFV石门株稀释至100TCID50/0.1 mL,与等体积的稀释后的血清混合,于37℃反应1 h。接种PK-15细胞,100μL/孔(病毒100TCID50/孔)。72 h后用800 m L/L冷丙酮固定,将CSF阳性血清作50倍稀释,100μL/孔,37℃反应 1.5 h,加入50倍稀释的FITC标记的兔抗猪IgG 50μL/孔,在37℃反应1 h后,用200μL PBS T洗涤5次,每次 5 min,加入30 μL 50 m L/L的甘油生理盐水,在荧光显微镜下观察结果。

1.6 4种猪瘟抗体检测试剂盒对70份临床血清的检测 中和试验对70份猪血清进行猪瘟抗体定性检测后,按试剂盒说明书,分别用 3种商品化ELISA试剂盒和1种正向间接血凝试剂盒依次对猪瘟抗体阳性血样和阴性血样进行重复性检测。计算4种商品化试剂盒相对中和试验的符合率(包括敏感性和特异性)。

2 结果与分析

2.1 中和试验及4种试剂盒检测70份临床血清70份血样经中和试验(100TCID50/孔)测定,4种试剂盒重复性试验结果见表1。

2.2 4种试剂盒相对中和试验的符合率

2.2.1 IDEXX试剂盒相对中和试验的符合率IDEXX试剂盒检测到20份阴性,50份阳性。其中50份两种方法检测均为阳性,10份两种方法检测均为阴性。计算得出 IDEXX试剂盒的特异性为100.0%(10/10),敏感性为83.3%(50/60),两种检测方法的结果符合率为85.7%[(50+10)/70][4]。见表2。

表1 中和试验及4种试剂盒检测结果

表2 IDEXX试剂盒相对中和试验的比较试验

2.2.2 LSI试剂盒相对中和试验的符合率 LSI试剂盒检测到12份阴性,58份阳性。其中57份两种方法检测均为阳性,9份两种方法检测均为阴性。计算得出LSI试剂盒的特异性为90.0%(9/10),敏感性为95.0%(57/60),两种检测方法的结果符合率为94.3%[(57+9)/70]。见表 3。

表3 LSI试剂盒相对中和试验的比较试验

2.2.3 JBT试剂盒相对中和试验的符合率 JBT试剂盒检测到8份阴性,62份阳性。其中60份两种方法检测均为阳性,8份两种方法检测均为阴性。计算得出JBT试剂盒的特异性为80.0%(8/10),敏感性为100.0%(60/60),两种检测方法的结果符合率为97.1%[(60+8)/70]。见表 4。

表4 JBT试剂盒相对中和试验的比较试验

2.2.4 IHA试剂盒相对中和试验的符合率 IHA试剂盒检测到7份阴性,63份阳性。其中55份两种方法检测均为阳性,2份两种方法检测均为阴性。计算得出IHA试剂盒的特异性为20.0%(2/10),敏感性为91.7%(55/60),两种检测方法的结果符合率为81.4%[(55+2)/70]。见表 5。

表5 IHA试剂盒相对中和试验的比较试验

2.2.5 4种试剂盒相对中和试验的符合率比较总结 见表6。

表6 4种试剂盒相对中和试验的符合率比较

3 讨论

从试验结果看,特异性上IDEXX最高,LSI次之,JBT第三,IHA最低。敏感性上JBT最高,LSI次之,IHA第三,IDEXX最低。在试剂盒的符合率比较中,JBT的符合率最高,LSI第二,IDEXX次之,IHA最低。

LSI试剂盒使用酶标葡萄球菌A蛋白作为酶标抗体,即PPA-ELISA,它检测的是猪体内的总抗体。不能区分BVDV和BDV,也有可能出现假阳性。所以更适合于抗体的动态监测和免疫效果评价。

JBT试剂盒采用的是猪瘟抗体竞争ELISA法,该法是建立在多重诱捕阻断ELISA技术上,使用了CSFV E2抗原和单克隆抗体,如果样品中存在抗E2糖蛋白的抗体,那么加入辣根过氧化物酶结合的抗E2糖蛋白单克隆抗体以及显色底物后,颜色将不会加深。它是一种用来检测猪血清中抗E2糖蛋白的抗体,是一种快速、简单、特异的方法,可以排除其他瘟病毒抗体,比如BVDV抗体的交叉反应。且包被抗原为真核的JBT试剂盒比原核的爱德士试剂盒的亲和性更高,敏感性更强。

IDEXX公司的ELISA猪瘟病毒抗体检测试剂盒所用的抗原是通过基因工程的方法生产的,纯度更高,此试剂盒采用阻断ELISA的模式,所用的单抗针对E2蛋白,检测E2抗体[6]。但它只能识别猪瘟两个位点中的一个,它所检测的是猪瘟病毒特异性抗体,且抗原为原核表达产物。因此检测结果可能会出现假阴性,不适合抗体的动态监测和免疫效果评价,但该种试剂盒可以区分BVDV和BDV,可以在引种监测和个体淘汰中广泛应用[5]。

IHA检测血清中猪瘟全病毒抗体,不能区分猪血清中的BVDV和BDV抗体[6-7],而猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)具有共同的糖蛋白抗原,即有血清学的交叉反应。而国外试剂盒所用的阻断ELISA模式所用的单抗只是针对猪瘟病毒中某种具有特异性的蛋白,从而检测所对应的特异性抗体,所以从某种程度上来说可以避免与BVDV发生交叉反应,提高检测结果的准确性。猪瘟IHA试验的优点就是不需要特殊检测仪器,直接用肉眼即可判定结果,适于在基层推广。但这也决定了其试验结果判定受主观人为因素影响极大,同时IHA的低特异性对检测结果带来困惑。

综上所述,从本次试验结果分析来看,4种方法均可使用,但最好使用LSI或JBT或IDEXX等进口ELISA试剂盒。以上4种方法根据实际情况加以灵活应用,不仅能够保证免疫监测工作的完成,且能够为防制猪瘟的暴发提供可靠的依据,还可以解决实际供应紧张等问题。但笔者认为,一个猪场进行疫病的免疫监测时,为了掌握疫苗免疫效果如何(如抗体水平、均匀度、持续时间),确定母源抗体消长规律,建立猪场免疫基线水平,最好不要经常变换检测方法,相对稳定的检测方法有利于猪场建立档案资料,为指导生产提供理论依据。所以我们要合理的选用试剂盒,更好的为生产服务。

[1]涂长春.我国猪瘟的流行原因与防制对策[J].动物保健,2004,4:20-21.

[2]杨汉春.盘点养猪2009之:我国主要猪病流行概况[J].猪业科学,2010,1:11-12.

[3]杨汉春.动物免疫学[M].2版.北京:中国农业大学出版社,2003:314.

[4]沈婷,周斌,陈溥言.检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J].畜牧与兽医,2010,42(4):1-6.

[5]李春树.猪瘟间接血凝试验的研究[J].中国兽医科技,1993,23(7):97-98.

[6]苗得园.Herdch ek猪瘟抗体E LISA试剂盒在猪瘟控制中的应用[J].中国兽医杂志,2006,42(11):50-51.

[7]李素,李尚波,王文成,等.阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较[J].动物医学进展,2007,28(10):40-43.