甘蓝黑腐病生理小种划分及其抗病性鉴定研究进展

黄德芬 李成琼 司 军 任雪松 宋洪元

（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400716）

甘蓝（Brassica oleraceavar.capitataL.）黑腐病是由黄单胞杆菌属甘蓝黑腐黄单胞杆菌（Xanthommonas campestrispv. campestris）引起的一种毁灭性病害（李树德，1995）。该病曾在19世纪90年代严重影响了美国威斯康星州东南部地区的甘蓝生产（Massomo et al.，2004）；20世纪50年代末在我国华北地区发生（陕西省植物保护研究所，1992），到了80年代已流行于全国各地，极大地威胁着甘蓝生产，严重时减产 70%（李明远，1993）。甘蓝黑腐病病原菌生理小种的划分和抗病性鉴定的方法直接关系到甘蓝抗病育种工作的开展和进程，本文就国内外常见的生理小种划分和抗病性鉴定方法作一简要阐述，以供我国甘蓝抗黑腐病育种工作者参考。

1 主要症状

黑腐病以甘蓝成株期发病最为常见，主要为害叶片，病菌由水孔侵入，多从叶缘发生，初呈水浸状病斑，后向内扩展呈“V”字形、黄褐色枯斑，病斑周围常有黄色晕圈；有时病菌沿叶脉向内扩展，使叶片产生黄褐色大斑或叶脉变黑呈网状；病菌也可从伤口侵入，在叶片的任何部位形成不规则的黄褐色病斑。重病株的茎部和根部维管束变黑，形成黑色空心干腐，叶内包心不紧，最终植株枯死。植株腐烂时没有臭味，此特点有别于软腐病。

2 病原菌生物学特征

甘蓝黑腐病菌呈短杆状，大小为（0.4～0.5）μm×（0.7～3.0）μm，单极生鞭毛，没有芽孢，但有荚膜，单生，部分为链生，经革兰氏染色后表现为阴性，属于好气性细菌。在牛肉琼脂培养基上培养的菌落呈灰黄色、圆形或稍不规则，表面湿润有光泽，但不粘滑；在马铃薯培养基上培养的菌落为淡黄色，并呈放线状。生长发育最适温度为 25～30 ℃，最高温度可达 38～39 ℃，最低温度为5 ℃，在51 ℃条件下，病菌最多存活10 min；生长发育的最适湿度为80%～100%（Swings & Civerolo，1993），对干燥的适应性很强，可存活12个月（Massomo et al.，2004），喜弱碱性（pH 7.4）环境。

3 生理小种划分

黑腐病菌生理小种的分化较为复杂，Kamoun等（1992）利用十字花科植物中的一些品种作为鉴别寄主进行了划分生理小种的研究，将病原菌划分成5个生理小种，即0、1、2、3、4号小种（表1）。之后，Vicente等（2001）利用 Wirosa F1（Brassica oleracea）、Just Right Hybrid Turnip（Brassica rapa）、Florida Broad Leaf Mustard（Brassica juncea）、Seven Top Turnip（Brassica rapa）、Miracl F1（Brassica oleracea）、PI199947（Brassica carinata）和 Line 14R of Cobra（Brassica.napus）等 7个十字花科蔬菜品种作为鉴别寄主将Xanthomonas campestrispv.campestris划分为6个生理小种，即1、2、3、4、5和6号小种（表2），其中1号小种占整体小种的62%，4号小种占32%，其余4个小种比较少，共占了6%。由此看出，生理小种1和生理小种4是引起芸薹属作物感染黑腐病最普遍的小种。Jensen等（2010）采用rep-PCR技术对尼泊尔的44个Xanthomonas campestrispv.campestris致病菌株进行生理小种划分，将其划分为5个生理小种，即 1、4、5、6和 7号小种。目前国际上比较常用的是 Vicente等（2001）的划分标准。

国内关于甘蓝黑腐病菌生理小种的分化研究还未见报道，但已有一些关于其致病力分化方面的研究。李经略等（1990）研究了北京、哈尔滨、重庆、陕西 4地的甘蓝黑腐病菌，结果表明不同生态环境形成的菌系对甘蓝苗期的致病力存在明显的分化现象，其中在陕西分离的YL-1致病力最强。程伯瑛等（2002）研究了来自山西和陕西的2个菌株，结果发现这2个菌株在同一甘蓝品种上的致病力表现略有差异。

表1 Kamoun等（1992）划分黑腐病菌生理小种的方法

表2 Vicente等（2001）划分黑腐病菌生理小种的方法

4 苗期抗病性鉴定

关于甘蓝黑腐病鉴定方法的研究较多，分别从群体、个体、细胞和分子等水平进行了研究，下面介绍几种常用的苗期抗病性鉴定方法。

4.1 剪叶接种

剪叶接种（龚静 等，2001）：用灭菌解剖刀蘸取浓度为1.0×108cfu·mL-1的菌液，在供试幼苗（4～6片真叶）叶片尖端垂直主脉的方向剪0.5～1.0 cm的切口接种。每剪1次均需蘸取菌液，每株剪2片，接种前后分别保湿24 h，接种后5～7 d调查发病情况，以叶片为单位，分级标准采用“八五”期间农业部统一制定的苗期抗病性鉴定方法及划分标准。

4.2 离体剪叶接种

离体剪叶接种（简元才和钉贯靖久，1994）：当植株长到4～5片真叶时，取从心叶往下数的第3片叶，然后将其从叶顶端往叶柄方向量取6 cm剪下。将小夹子浸入浓度为1.0×108cfu·mL-1的菌液中，在离近叶端至主叶脉 0.5 cm处剪叶接种。将接种后的叶片放入灭菌后铺有滤纸的塑料盒内，加无菌水保湿 1～2 h取出，在叶片的接种伤口处滴 1滴菌液，放入28 ℃的培养箱内培养，5 d后调查发病情况。按三角形面积公式计算病斑面积（病斑面积=宽×高/2）。抗性分级标准为：免疫（I）或高抗（HR），0＜病斑面积≤0.5 cm2；抗病（R），0.5 cm2＜病斑面积≤2.0 cm2；耐病（T），2.0 cm2＜病斑面积≤3.0 cm2；感病（S），病斑面积＞3.0 cm2。

4.3 喷雾接种

喷雾接种（李永镐和徐丽波，1990）：接种前1 d将4～6片真叶期的植株保湿24 h，第2天早晨用小型喷雾器将浓度为1.0×108cfu·mL-1的菌液均匀喷于叶片表面，每株用量1 mL，接种后保湿24 h，14 d后调查发病情况，以叶片为单位，病情分级标准采用“八五”期间农业部统一制定的苗期抗病性鉴定方法及划分标准。

4.4 针刺接种

针刺接种（崔瑞峰，2004）：在植株 4～6片真叶期，用灭菌后的接种针蘸取菌液，在主脉至叶缘0.5～1.0 cm处进行针刺接种，接种菌液浓度为1.0×108cfu·mL-1，每接种1次均需蘸取菌液，接种前后分别保湿24 h，每株处理2片叶，接种后5～7 d调查发病情况，以叶片为单位，病情分级标准采用“八五”期间农业部统一制定的苗期抗病性鉴定方法及划分标准。

4.5 水孔接种

水孔接种（Staub & Willians，1972）：将4～6片真叶期的植株放入泡沫塑料箱内，每箱底部装1～2 cm静水，将浓度为1.0×109cfu·mL-1的菌液喷到植株表面，至叶片潮湿为止，接种后保湿48 h，12 d后调查发病情况。病情分级标准参照Staub和Willians（1972）的划分标准。

4.6 吐水接种

吐水接种（肖崇刚，1994）：在接种前1 d将4～6片真叶期的植株保湿24 h，使其边缘产生露珠，用特制玻璃纤维蘸取浓度为 1.0×109cfu·mL-1的菌液通过吐水液滴接种，分别作保湿12 h与不保湿处理，然后将植株放入15～20 ℃温室内自然条件生长，接种14 d后调查发病情况。病情分级标准采用“八五”期间农业部统一制定的苗期抗病性鉴定方法及划分标准。

喷雾法接种是国内外采用较为普遍的一种方法，李永镐和徐丽波（1990）认为，喷雾接种后病原菌在水孔处繁殖，并扩展蔓延，这种方法能充分体现出寄主的抗扩展能力，还能够反映其抗侵入的特性，能够比较全面地反映寄主的抗病性，其鉴定结果与田间自然发病情况相似，而且该方法还具有简单、方便、快速、省时、省力等特点，比较适用于甘蓝黑腐病的抗病性鉴定。龚静等（2001）采用喷雾法对38份甘蓝材料进行抗病性鉴定，结果表明各材料之间病情指数差异较大，能够比较明显区分抗感材料。但喷雾法必须要注意保湿，防止漏接现象。吐水法接种可以避免漏接现象，而且鉴定结果较为准确，但费时费力，接种难度比较大。龚静等（2001）研究认为用剪叶法接种后，各材料的抗病性差异表现不明显，不能较为准确地区分抗感材料，所以该接种方法不适于甘蓝黑腐病的抗病性鉴定，这与肖崇刚（1994）的研究结果较为一致。离体接种不易受外界条件的影响，环境条件易于控制，可周年进行，且省时省力（简元才和钉贯靖久，1994）。离体剪叶法操作比较方便，而且不受外界环境的影响，较易控制。王超等（2000）认为，离体剪叶法比较适用于甘蓝黑腐病的苗期抗病性鉴定。目前国内外关于离体剪叶法的研究还比较少，在今后接种研究中有更广阔的前景。

5 问题与展望

目前，我国关于甘蓝黑腐病菌生理小种分化的研究比较多，但对其鉴定系统尚未见报道；已收集了一些致病力不同的相关菌株，并进行了菌系分化研究，但没有开展系统的生理小种鉴定研究。在今后的研究工作中，还应加大对其生理小种分化的鉴定方法研究，找到一套详细的甘蓝黑腐病生理小种鉴别寄主，以更好的了解我国甘蓝黑腐病菌生理小种的分布情况，对有针对性地进行甘蓝抗黑腐病育种具有重要意义。

从上述甘蓝抗病性鉴定方法可以看出，均是通过接种甘蓝黑腐病菌后观察其鉴定材料的外观来确定其抗病性，而这些外在表现症状都是受基因所控制的，所以最可靠、最直接确定一个材料的抗病性的方法是通过分子辅助选择来检测该材料是否具有抗病基因。目前已取得了一些进展，Bain（1955）认为甘蓝对黑腐病的抗性是由1个或多个显性基因控制的；Hunter（1987）在鉴定B. napus抗病品种PI436606后认为甘蓝对黑腐病的抗性由1个显性基因控制的；Dickson和Hunter（1987）认为此抗性受1对隐性基因控制，并在另一耐黑腐病的株系中发现多个修饰基因；张峰和宋文芹（1999）利用AFLP-银染法发现其中1个400 bp的抗病标记可能与甘蓝黑腐病抗性基因紧密连锁。在今后的工作中，还需要进一步研究抗黑腐病的基因，寻找并克隆出对甘蓝黑腐病免疫或高抗的单基因，从而完善甘蓝黑腐病的抗性鉴定方法，为甘蓝的抗病育种提供依据。

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