妇血宁颗粒的质量标准研究

张伏军，尹小玲，李卿，须建（.重庆三峡中心医院药剂科，重庆市404000；.重庆市中药研究院，重庆市 400065；.重庆医药高等专科学校，重庆市 40）

妇血宁颗粒是在多年使用的临床验方基础上，经现代工艺制成的中药复方制剂，本品由三七、断血流、阿胶等药材组成，临床证实其具有养血止血、祛瘀补虚的功效，适用于治疗瘀血出血、血虚出血以及妇科各类血证。为有效控制其质量，笔者对该产品的质量标准进行了研究，用薄层色谱（TLC）法对制剂中的三七、断血流进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定三七中的有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的含量。

1 仪器与试药

1100HPLC仪，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器（美国惠普公司）；薄层成像色谱仪（瑞士卡玛公司）。

三七皂苷R1（批号：110745-700415）、人参皂苷Rb1（批号：0703-200118）、人参皂苷Rg1（批号：110703-700425）对照品和三七（批号：120941-200506）、断血流（批号：120579-200704）对照药材，均由中国食品药品检定研究院提供；妇血宁颗粒（重庆市中药研究院自制，批号：101001、101101、101102）；缺三七阴性样品、缺断血流阴性样品由重庆市中药研究院中药化学研究所提供；甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 三七的TLC鉴别 取本品2 g，研细，加甲醇20m L，水浴回流30m in，滤过，滤液蒸干，残渣加水20m L使溶解，用水饱和正丁醇提取2次，每次20m L，合并水饱和正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2m L使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1m L各含1 mg的溶液，作为混合对照品溶液；另取缺三七阴性样品2 g，同法制成缺三七阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。三七的TLC见图1。

2.1.2 断血流的TLC鉴别 取本品2 g，研细，加甲醇20m L，水浴回流30min，滤过，滤液过中性氧化铝柱，用40%甲醇40 m L洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水20m L使溶解，用水饱和正丁醇提取2次，每次20m L，合并水饱和正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次20m L，弃去水液，水饱和正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2m L使溶解，作为供试品溶液；另取断血流对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再取缺断血流阴性样品2 g，同法制成缺断血流阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述溶液各8µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。断血流的TLC见图2。

图1 三七的TLC 1.缺三七阴性对照；2.三七对照药材；3.供试品；4.混合对照品（从下往上依次为人参皂苷Rb1、三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1）Fig 1 TLC of Panax notoginseng 1.negative control w ithout P.notoginseng；2.Notoginseng Radix etRhizoma reference substance；3.test sample；4.m ixed contro（lthey were as follws from the bottom up：ginsenoside Rb1，notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1）

图2 断血流的TLC 1.供试品；2.断血流对照药材；3.缺断血流阴性对照Fig 2 TLC of Clinopodium Herb 1.testsample；2.Clinopodium Herb referencesubstance；3.negative controlw ithoutClinopodium Herb

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Symmetry C18柱（250mm×4.6 mm，5 µm）；流 动 相 ：甲 醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0→30min，15%A→45%A；30→40 m in，45%A→65%A；40→50 min，65%A→80%A）；流速：1.0 m L·m in-1；检测波长：203 nm；柱温：25 ℃；进样量：10μL。理论板数按三七皂苷R1色谱峰计算应不低于4 000，阴性对照溶液在混合对照品相应位置无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。色谱见图3。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约2.5 g，精密称定，加水30m L使溶解，水饱和正丁醇提取4次，每次20 m L，合并水饱和正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次50m L，弃去氨试液，水饱和正丁醇液蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，移置5m L量瓶中，加甲醇定容，摇匀，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每1 m L含三七皂苷R10.22mg、人参皂苷Rb10.41mg、人参皂苷Rg10.37mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺三七阴性样品，照上述供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、16、20 µL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，µg）为横坐标，进行线性回归，得回归方程分别为Y三七皂苷R1＝912 846X三七皂苷R1－1 971.5（r＝0.999 8）、Y人参皂苷Rb1＝1 320 459X人参皂苷Rb1－2 711（r＝0.999 9）、Y人参皂苷Rg1＝1 215 946X人参皂苷Rg1－3 047（r＝0.999 7）。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1进样量分别在0.44～4.40、0.82～8.20、0.74～7.40µg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10µL，重复进样6次，测定峰面积积分值。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1峰面积的RSD分别为0.84%、0.97、0.92%（n均为6），表明仪器精密度良好。

图3 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.缺三七阴性对照；1.三七皂苷 R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1Fig 3 HPLC chromatogram s A.m ixed control；B.test sample；C.negative control w ithout P.notoginseng；1.notoginsenoside R1；2.ginsenoside Rg1；3.ginsenoside Rb1

2.2.7 稳定性试验 精密称取样品1份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下条件分别于0、1、4、8、10、14 h进样测定。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1峰面积的RSD分别为1.01%、0.95、1.04%（n均为6）。表明供试品溶液在14 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 精密称取同一批样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下条件测定峰面积。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的RSD分别为1.12%、1.08%、0.99%（n均为6），表明方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 精密量取已知含量的同批样品6份，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Resultsof revovery test

2.3 样品含量测定

精密称取3批样品（批号：101001、101101、101102）各2.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见表2。

3 讨论

试验中，鉴别三七和断血流[2]所采用的TLC法不受样品中其他各药的干扰，专属性较强，简单易行，可作为本品中三七、断血流定性检测方法；笔者曾对制剂中阿胶进行了TLC鉴别方法的研究，由于处方中阿胶量较小，TLC鉴别方法缺乏专属性，故未能纳入标准。

表2 样品含量测定结果Tab 2 Resultsof contentsdeterm ination

本制剂由三七、断血流等药材提取制成，样品成分复杂，采用HPLC法测定三七中主要成分含量，对供试品溶液的提取方法进行了比较[3～9]：中性氧化铝吸附法、水饱和正丁醇萃取法、大孔树脂法。试验结果表明，采用样品加水使溶解，水饱和正丁醇萃取，氨试液洗涤的方法操作较简便，且含量测定结果准确，重复性好，故纳入标准。

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