甘肃当归炮制前后HPLC特征图谱及阿魏酸含量测定研究

张 永，高昌琨，严安定（安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥市 230022）

当归作为常用中药材，始载于《神农本草经》，被列为中品，已有2 000多年的药用历史。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效[1]，主产于甘肃、云南、陕西、四川等地。甘肃是当归的传统道地产区，产量约占全国总产量的90%。甘肃当归以产量高、质量优而享有盛誉，特别是“岷归”更是驰名古今、蜚声海外。由于当归的质量除了受土壤、光照、气候等环境因素影响外，还与药材的品种、产地、采收加工等因素密切相关，因此不同产地的当归质量各不相同[2]；即使同一产地的当归，其质量也有一定的差异[3]。而且，当归在临床上常以炮制品入药，不同的炮制过程对其质量的影响也各不相同[4]。因此，有必要建立一种评价当归炮制过程质量变化的方法，以全面评价当归不同炮制品的质量，保证饮片疗效。

本研究中，笔者以甘肃3个主产地的当归为研究对象，利用特征图谱技术[5]建立了甘肃当归的高效液相色谱（HPLC）特征图谱分析方法，并在相同色谱条件下对炮制前后甘肃当归中阿魏酸的含量进行了测定，建立了更加全面合理的中药饮片鉴别和质量评价方法。

1 仪器与试药

LC-20AB HPLC仪，包括DGU-20A3在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD-M 20A检测器、CTO-20A柱温箱和Class-VP色谱工作站（日本岛津公司）；KQ5200DB数控超声波清洗器（功率：250W，频率：40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；AL104电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

甲醇、乙腈为色谱纯（美国Merck公司），其他试剂均为分析纯；阿魏酸标准品（南京泽朗医药科技有限公司，纯度＞98%）；收集3个主产地当归药材各50 kg，分别产自甘肃漳县（批号：091128）、甘肃渭源（批号：090606）、甘肃岷县（批号：090605），均由合肥和义堂中药饮片有限公司提供，经安徽中医学院刘守金教授鉴定为伞形科植物当归A.sinensis（Oliv）Diels的干燥根，标本保存于安徽医科大学第一附属医院药剂科，标 本编号 分别为 AMR-091128、AMR-090606、AMR-090605。

2 方法与结果

2.1 当归片与酒当归的炮制加工

不同产地的甘肃当归样品均由合肥和义堂中药饮片有限公司在生产条件下加工炮制成当归片和酒当归。取不同产地的当归药材，清洗后用水淋洗软化，用切药机切成1.5mm的薄片，置烘箱中50℃干燥4 h至干，即得当归片；取当归片，按100 kg当归片加10 kg黄酒的比例加黄酒拌匀、润透，然后置炒药机中95℃炒制20m in至干，颜色呈深黄棕色，即得酒当归。具体炮制加工流程见图1。

图1 当归炮制加工过程示意图Fig 1 Flow chartof A.sinensis processing

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent HC-C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：35 ℃；流速：1.0m L·min-1；检测波长：254 nm；流动相：乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30min，5%～18%A；30～65m in，18%～38%A；65～75min，38%～50%A；75～85 min，50% ～56%A；85～95 min，56%A；95～110 min，56%～65%A；110～120 min，65%～85%A；120～125 min，85%～5%A）；进样量：10μL。

2.3 标准品溶液的制备

精密称取阿魏酸标准品5.0mg，置于5m L量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为1.000mg·m L-1的阿魏酸标准品溶液，冷藏备用。

2.4 供试品溶液的制备

精密称取当归样品粉末1.0 g，置100m L具塞锥形瓶中，加甲醇30m L，密塞，超声提取30m in，取出放冷，用滤纸滤过，药渣连同滤纸放回锥形瓶中，再加甲醇30m L，同法再超声提取1次，放冷，用滤纸滤过，合并2次滤液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10m L容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。进样前以0.45μm微孔滤膜过滤。

2.5 甘肃当归炮制前后特征图谱的建立

2.5.1 精密度试验 取甘肃渭源当归供试品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，以阿魏酸峰为标准峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.118%，相对峰面积的RSD均＜2.13%，表明方法精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取甘肃渭源当归供试品溶液适量，分别于0、4、8、12、16、24 h进样分析。结果，各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.109%，相对峰面积的RSD均＜2.14%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取甘肃渭源当归样品适量，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件分别进样分析。结果，各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.138%，相对峰面积的RSD均＜5%，表明方法重复性良好。

2.5.4 特征峰的指认 精密吸取阿魏酸标准品溶液5μL，注入色谱仪，按“2.2”项下色谱条件进样分析，确定在此色谱条件下阿魏酸的位置（图2）；同时，以甲醇为空白溶剂进样5μL，确认空白溶剂中相应位置没有干扰峰存在。

图2 阿魏酸的HPLC图Fig 2 HPLC chromatogramsof ferulic acid

2.5.5 甘肃当归炮制前后特征图谱的测定 分别精密称取甘肃漳县当归片与酒当归、甘肃渭源当归片与酒当归、甘肃岷县当归片与酒当归样品适量，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件进样分析，建立各样品的特征图谱，详见图3。

图3 甘肃当归炮制前后HPLC特征图谱A.漳县当归片；B.漳县酒当归；C.渭源当归片；D.渭源酒当归；E.岷县当归片；F.岷县酒当归；1～8.共有峰；1.阿魏酸Fig 3 HPLC specific chromatogram s of crude and processed A.sinensis A.crude A.sinensis from Zhangxian；B.processed A.sinensis from Zhangxian；C.crude A.sinensis from Weiyuan；D.processed A.sinensis from Weiyuan；E.crude A.sinensis from M inxian；F.processed A.sinensis from M inxian；1～8.common peaks；1.ferulic acid

由图3可以看出，甘肃不同产地当归的HPLC特征图谱中各成分的种类差别不大，采用特征图谱技术可以有效鉴别甘肃当归药材。但甘肃不同产地当归炮制前后的HPLC特征图谱中某些成分的含量发生了明显变化，如炮制后2、3、4号峰含量明显降低，1、6号峰含量略有降低，说明炮制对当归成分含量具有一定的影响。

2.6 甘肃当归炮制前后阿魏酸的含量测定

2.6.1 线性关系考察 精密量取适量的阿魏酸标准品溶液置于容量瓶中，用甲醇配成系列标准溶液，使浓度分别为1.000、0.100、0.050、0.020、0.010、0.001mg·m L-1，按“2.2”项下色谱条件分别进样10μL测定。以标准品溶液的质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备阿魏酸的标准曲线，得回归方程为Y＝18 361 200.531X+23 738.962（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，阿魏酸的质量浓度在0.001～1.000mg·m L-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验 取阿魏酸标准品溶液5μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定。结果，RSD＝0.57%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取甘肃渭源当归供试品溶液适量，分别于配制后0、4、8、12、16、24 h进样测定。结果，RSD＝1.13%（n＝6），表明供试品溶液中阿魏酸在24 h内稳定。

2.6.4 重复性试验 取甘肃渭源当归样品适量，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件分别进样分析。结果，RSD＝2.70%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的甘肃渭源当归样品粉末6份，每份0.5 g，分别精密加入相当于含阿魏酸0.4 mg的标准品溶液，混匀，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.6.6 炮制前后阿魏酸含量测定 分别精密称取甘肃漳县当归片与酒当归、甘肃渭源当归片与酒当归、甘肃岷县当归片与酒当归样品适量，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件分析。各供试品溶液分别进样测定3次，以峰面积按标准曲线法计算各样品中阿魏酸的含量，并计算平均值，结果见表2。

表2 甘肃当归炮制前后阿魏酸的含量Tab 2 Contents of ferulic acid in crude and processed Gansu A.sinensis

由表2可见，甘肃不同产地当归中阿魏酸的含量有较大差异，但成分种类和成分间的比例关系基本相似，原因可能为阿魏酸含量受当归的品种、产地和采收期影响较大。此外，研究还发现甘肃不同产地当归炮制后阿魏酸含量略有降低。由此可见，在整体特征图谱相似性良好的情况下，饮片所含有效成分的含量仍然可能存在较大差异。因此，有必要在特征图谱评价的基础上增加指标性成分的含量测定，从而全面评价中药饮片的质量。

3 讨论

3.1 样品提取方法的选择

本研究对样品的提取方法进行了考察，以共有峰的峰面积作为评价指标，分别采用加热回流提取和超声提取来制备甘肃渭源当归供试品溶液，提取次数分别考察了1、2、3次，将各样品按“2.2”项下色谱条件进行液相分析。结果发现，采用不同提取方法、不同提取次数，对8个共有成分的提取率各不相同。考虑到尽量多的提取成分和操作简单、快速等因素，采用甲醇超声提取2次，每次30m in作为样品提取工艺。

3.2 样品提取溶剂的选择

本研究分别采用20%、40%、60%、80%和100%甲醇提取甘肃渭源当归样品，制备不同提取溶剂的供试品溶液，将各样品按“2.2”项下色谱条件进行液相分析，以8个共有峰的峰面积为评价指标。结果发现，采用不同提取溶剂对8个共有成分的提取率各不相同。考虑到尽量多的提取成分，采用100%甲醇作为提取溶剂。

3.3 测定波长的选择

本研究比较了210、230、254、260、280、365 nm等波长下供试品溶液的出峰情况，发现其在254 nm波长处各峰分离好，整体峰形优于其他波长，峰形也好，溶剂干扰少，基线平稳，故选用254 nm作为特征图谱测定波长。

3.4 流动相的选择

本研究比较了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液等溶剂系统进行梯度洗脱，结果以乙腈-乙酸水溶液系统所得图谱的峰形较好、分离度高，所以选用乙腈-0.2%乙酸水溶液作为本试验的流动相系统。

3.5 柱温和流速的选择

本研究比较了不同柱温（25、35、45℃）及不同流速（0.8、1、1.2m L·m in-1）条件下样品的HPLC特征图谱。结果发现，柱温35℃、流速1m L·m in-1时，样品分离度较好、峰形对称，能够满足分析要求。

3.6 小结

本研究结果表明，特征图谱技术可以有效进行中药饮片的鉴别，甘肃不同产地当归饮片的HPLC特征图谱差异不大，但是在整体图谱相似性良好的情况下，药材所含有效成分的含量仍然可能存在较大差异，如当归中的主要成分阿魏酸在不同样品中含量各不相同[6，7]。因此，有必要在特征图谱评价基础上增加有效成分的含量测定，从而全面评价中药饮片的质量，建立更加全面、科学、合理的中药饮片质量评价体系。

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