不同采收期青翘和连翘叶中活性成分的含量比较Δ

2011-08-07张淑蓉裴香萍王晶晶山西中医学院太原市030024

中国药房 2011年31期

张淑蓉，裴香萍，闫艳，王晶晶（山西中医学院，太原市 030024）

连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。连翘药用历史久远，但多为野生，资源有限。为便于连翘资源的综合开发利用，近年来研究人员对连翘不同部位的活性成分进行了比较研究[1～3]。在我国山西、陕西等地，将连翘叶作茶饮用已有较长历史。现代药理研究证实，连翘叶具有抗菌、保肝、抗氧化及抗衰老等作用[4～8]。本试验参考相关文献[9，10]，采用高效液相色谱（HPLC）法，使用同一色谱系统同时测定不同采收期青翘和连翘叶中连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量，并比较青翘和连翘叶中活性成分的含量变化，以确定青翘和连翘叶的最佳采收期。

1 仪器与试药

HPLC仪，包括Waters2695二元液相色谱泵、Waters2998光电二极管阵列检测器（美国Waters公司）；FA/JA1004型万分之一天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ5200V型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

试验用水为双蒸水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；连翘苷（批号：110821-200610）、芦丁（批号：100080-200707）对照品均购自中国药品生物制品检定所（供含量测定用）；连翘酯苷标准品（辽宁省生物医药研究所，纯度＞98.0%）；青翘和连翘叶于2008年6月－10月采自山西太原，由山西中医学院中药鉴定教研室牛燕珍讲师鉴定分别为连翘F.suspense（Thunb.）Vahl的果实和叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～8 min，30%～33%A；8～24 min，33%～40%A；24～39 min，40%～48%A；39～55 min，48%～64%A；55～65 min，64%～30%A；65～75 min，30%A）；检测波长：280 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：室温。在此色谱条件下，对照品和供试品溶液中各色谱峰的分离度良好，其他成分对连翘酯苷、芦丁和连翘苷的含量测定无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取连翘酯苷标准品与芦丁、连翘苷对照品各适量，置同一5 mL量瓶中，加甲醇制成浓度分别为1.480、0.326、0.586 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

将不同采收期的青翘蒸制30 min、60℃烘干；连翘叶自然晾干，研细。精密称取0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称重，超声提取（功率：150 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称重，用50%甲醇补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列浓度的对照品溶液。分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得连翘酯苷的回归方程为Y＝1 005 505.0X－4 593.6（r＝0.999 9，n＝6），线性范围为0.74～14.80 μg；芦丁的回归方程为Y＝879 780.0X+2 959.1（r＝0.999 7，n＝6），线性范围为0.163～3.260 μg；连翘苷的回归方程为Y＝761 687.0X+38 560.6（r＝0.999 8，n＝6），线性范围为0.293～5.860 μg。

2.5 精密度试验

精密吸取连翘酯苷（0.74 mg·mL-1）、芦丁（0.163 mg·mL-1）、连翘苷（0.293 mg·mL-1）混合对照品溶液 10 µL，重复进样6次，测定峰面积。结果，连翘酯苷、芦丁、连翘苷峰面积的RSD分别为1.13%、1.07%、0.91%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 µL，于0、3、6、9、12 h分别进样测定，记录峰面积。结果，连翘酯苷、芦丁、连翘苷峰面积的RSD分别为0.99%、1.44%、1.25%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一样品（于2008-07-31采收的连翘叶）粉末0.5 g，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件分析测定。结果，连翘酯苷、芦丁和连翘苷的平均含量分别为4.00%、0.91%、1.32%，RSD分别为1.95%、2.45%、2.42%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一样品（于2008-07-31采收的连翘叶）粉末0.25 g，共6份，分别精密加入连翘酯苷、芦丁、连翘苷混合对照品溶液（浓度分别为1.92、0.42、0.64 mg·mL-1）5 mL，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取不同采收期的样品粉末，分别精密称取0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定样品中3种成分的含量，结果见表2（表中“-”表示10月中旬已采收不到青翘）。青翘和连翘叶中测定成分随采收日期的变化趋势见图2。

3 讨论

本试验结果显示，连翘酯苷的含量青翘高于同期连翘叶，芦丁和连翘苷的含量则是连翘叶高于同期青翘。连翘叶能否代替青翘使用及两者的药效作用比较有待进一步研究。青翘中连翘酯苷、芦丁和连翘苷3种成分均是7月上旬含量最高，以后逐渐降低，故青翘以7月份采收为宜；连翘叶中连翘酯苷和连翘苷含量在6月最高，以后逐渐降低，9月下旬有所回升，之后又降低；芦丁则是7月含量最高，之后变化趋势同连翘酯苷和连翘苷，因此连翘叶以6～7月采收为宜。6～7月份叶子处于生长旺盛时期，此正符合叶类药材的一般采收规律。为避免较早采收叶子可能对果实造成的不利影响，建议在采收连翘果之后再采收连翘叶；另外，亦可以在9月下旬活性成分回升时采收连翘叶，以充分利用资源。