微乳液相色谱法同时测定大黄中5种蒽醌类衍生物的含量Δ

何素珍，张忠义，张守尧（南方医科大学珠江医院药剂科，广州市510282）

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄R.tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄R.officinaleBaill.的干燥根及根茎，具有泻下、通瘀导滞、抗菌消炎、止痛止血、抗肿瘤、抗氧化和降血脂等作用[1]，并应用于临床多种危重急症的抢救治疗[2]。大黄的主要有效成分为蒽醌类衍生物，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及与葡萄糖结合成的苷[3]。微乳液相色谱（MELC）法是一项液相色谱新技术[4]，它不仅存在常规色谱的分离机制，还存在微乳液滴内外相之间的分配[5]。其与常规高效液相色谱（HPLC）法相比，具有分离效率高和分离速度快的优越性，可用于复杂样品的分离；血清、尿液经过简单的稀释后便可以直接进样分析，无需预处理；在梯度洗脱和低紫外波长（190 nm）检测方面也有一定的优势[6～10]。对于MELC法的应用，主要涉及化学药品中多种成分、药物制剂以及生物样品的分析[11，12]，而用于中药成分的分析较少。笔者采用MELC法同时测定了大黄中5种蒽醌类衍生物的含量，方法简便、准确、可靠，取得了满意结果。

1 仪器与试药

Agilent 1100型HPLC仪，配二极管阵列检测器及化学工作站（美国安捷伦科技有限公司）；KQ-600DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司，功率：600 W，工作频率：40 kHz）。

芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品和掌叶大黄、唐古特大黄药材（中国药品生物制品检定所，批号 分 别 为 110795-200504、110757-200206、110756-200110、110796-200513、 110758-200610、 121249-200402、 120902-200609）；药用大黄（购于广州市药材公司，经南方医科大学珠江医院药剂科周本杰主任药师鉴定为真品）；十二烷基硫酸钠（SDS，化学纯，西陇化工股份有限公司，批号：0911191）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；水为注射用水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品各适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，再加甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。临用前用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液进样。

2.1.2 供试品溶液 取干燥后的各大黄药材粉末（过四号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声使溶解，再加氯仿10 mL，加热回流1 h，放冷，转移至分液漏斗中，用少量氯仿分次洗涤烧瓶，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用氯仿提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，挥去溶剂，残渣加少量甲醇使溶解，定量转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。临用前用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液进样。

2.2 微乳流动相的制备

将SDS、正丁醇、正辛烷及含0.5%三乙胺的水溶液按顺序混合，超声15 min，即得透明稳定的微乳，用磷酸调pH值至3.0，经0.45 μm滤膜过滤，备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1 mL·min-1；柱温：28 ℃；检测波长：254 nm；流动相：2.5%（W/V）SDS-0.1%（V/V）正辛烷-8.0%（V/V）正丁醇-0.5%（V/V）三乙胺（磷酸调pH值至3.0）；进样量：15 μL。色谱见图1。

图1 微乳液相色谱图Fig 1 Microemulsion liquid chromatograms

2.4 线性关系考察

精密量取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置6个10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.3”项下色谱条件，取15 μL进样测定，每个混合对照品溶液进样3次。分别以浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，对应的平均峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得出大黄中5种蒽醌类衍生物的回归方程，详见表1。

表1 5种蒽醌类衍生物对照品的标准曲线Tab 1 Standard curves of 5 anthraquinone derivatives

2.5 精密度试验

取“2.4”项下芦荟大黄素浓度分别为18.8、37.6 μg·mL-1的混合对照品溶液适量，连续进样6次。结果，各化合物峰面积的RSD（n＝6）分别为芦荟大黄素0.49%、0.91%，大黄酸0.48%、0.72%，大黄素0.69%、0.78%，大黄酚0.86%、0.94%，大黄素甲醚1.29%、1.22%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.4”项下芦荟大黄素浓度为28.2 μg·mL-1的混合对照品溶液适量，室温避光，每隔1 h进样一次，重复7次。结果，各化合物峰面积的RSD（n＝7）分别为芦荟大黄素0.28%、大黄酸0.57%、大黄素0.58%、大黄酚0.38%、大黄素甲醚1.23%，表明大黄中5种蒽醌类衍生物在7 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的样品适量，共6份，精密称定，精密加入一定量的混合对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 5种蒽醌类衍生物的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests for 5 anthraquinone（n＝6）

2.8 重复性试验

取同一批大黄药材粉末（过四号筛）6份，各约0.3 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。结果，各化合物平均含量的RSD（n＝6）分别为芦荟大黄素0.38%、大黄酸0.52%、大黄素0.85%、大黄酚1.03%、大黄素甲醚0.48%，表明本方法重复性良好。

2.9 样品含量测定

取3种大黄药材粉末（过四号筛）各约0.3 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算大黄中5种蒽醌类衍生物的含量，结果见表3。

表3 MELC法测定3种大黄中5种蒽醌类衍生物的含量结果（mg·g-1）Tab 3 Results of content determination of 5 anthraquinone in 3 kinds of Rhei Radix Et Rhizoma by MELC（mg·g-1）

3 讨论

3.1 表面活性剂浓度对分离的影响

在微乳稳定区域范围内，考察SDS浓度在20.0～35.0 g·L-1范围变化时的试验结果，发现随着SDS浓度增加，芦荟大黄素与大黄酸的分离度降低，保留时间相应缩短；当SDS浓度在25.0 g·L-1时，分离效果和保留时间最为理想，故确定表面活性剂SDS的试验浓度为25.0 g·L-1。

3.2 助表面活性剂含量对分离的影响

改变助表面活性剂正丁醇的含量，对保留时间和分离效果有影响。笔者考察了正丁醇含量在4.0%～15.0%范围变化时的试验结果，发现随着正丁醇含量的增加，保留时间相应缩短。综合考虑组分分离度和保留时间，确定助表面活性剂正丁醇的浓度为8.0%。

3.3 油相含量对分离的影响

改变油相正辛烷的含量，可以改变物质的保留时间和分离度。笔者考察了正辛烷含量在0.1%～1.4%范围变化时对分离效果的影响，发现随着正辛烷含量的降低，芦荟大黄素与大黄酸、大黄酚与大黄素甲醚的分离度相应提高，保留时间相应延长；当正辛烷的含量为0.1%时，分离效果最理想，故确定油相正辛烷的含量为0.1%。

3.4 pH值对分离的影响

在微乳体系中，用磷酸调流动相pH值在2.5～7.0范围，考察试验结果，发现改变pH值主要是影响芦荟大黄素的保留时间，随着pH值的增加，芦荟大黄素的保留时间相应缩短；当pH值为3.0时，效果最为理想，故选择流动相pH值为3.0。

3.5 添加剂对分离的影响

采用SDS-正辛烷-正丁醇-0.5%三乙胺微乳流动相，分别添加有机溶剂，使成微乳-甲醇（95∶5，V/V）、微乳-乙腈（95∶5，V/V）流动相进行试验。结果显示，加入有机添加剂后，对组分分离度无影响，但保留时间延长。

本试验建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物含量的微乳液相色谱法。结果表明，5种蒽醌类衍生物达到基线分离，精密度在0.48%～1.29%之间，准确度高；加样回收率在97.53%～101.37%之间；具有较宽线性范围和良好的线性关系（r在0.998 7～0.999 9之间）。同时也表明，采用微乳流动相同样可以分离成分复杂、性质相近的中药里的多种成分，而且有机溶剂用量少、毒性低、相对的费用和污染较少，可成为中药质量控制方法的新选择。

[1] 李 娟，李 坚.大黄药理作用研究及临床应用概况[J].实用医药杂志，2006，23（9）：1 132.

[2] 涂久生，于立军.大黄在危重急症临床应用中的最新进展[J].中国药房，2008，19（36）：2 868.

[3] 吕慧英，赵晨曦，梁逸曾，等.5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2 490.

[4] 李 宁，黄光亮，李玉兰，等.微乳液相色谱法同时测定山楂叶提取物中4种黄酮成分[J].分析化学研究简报，2009，37（12）：1 791.

[5] 张守尧，周苏秦，王秉钧，等.微乳液相色谱法测定虎杖中2种成分的含量[J].今日药学，2009，19（2）：41.

[6] Marsh A，Clark B，Altria K.A review of the background，operating parameters and applications of microemulsion liquid chromatography（MELC）[J].J Sep Sci，2005，28（15）：2 023.

[7] Simon M Bryant，Kevin D Altira.An initial assessment of the use of gradient elution in microemulsion and micellar liquid chromatography[J].J Sep Sci，2004，27（17-18）：1 498.

[8] Eamon M，Sheila D，Joe P，et al.Application of MELC and MEEKC for the analysis of paracetamol and related impurities in suppositories[J].Chromatographia，2008，68（1-2）：49.

[9] El-Sherbiny DT，El-Ashry SM，Mustafa MA，et al.Evaluation of the use of microemulsions as eluents in high-performance liquid chromatography[J].J Sep Sci，2003，26（6-7）：503.

[10] Malenovic A，Ivanovic D，Medenica M，et al.Retention modelling in liquid chromatographic separation of simvastatin and six impurities using a microemulsion as eluent[J].J Sep Sci，2004，27（13）：1 087.

[11] Walash MI，Belal F，EL-Eeany N，et al.Microemulsion liquid chromatographic determination of nicardipine hydrochloride in pharmaceutical preparations and biological fluids application to stability studies[J].J Liq Chromatogr Related Technol，2007，30（8）：1 015.

[12] Jancic B，Ivanovic D，Medenica M，et al.Development of liquid chromatographic method for fosinoprilat determination in human plasma using microemulsion as eluent[J].J Chromatogr A，2005，1 088（1-2）：187.