沙棘果油对小鼠免疫调节的实验研究

2011-08-04邹元生李新兰

水资源开发与管理 2011年4期

邹元生，聂勇，李新兰

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100037；2.河北神兴沙棘研究院，石家庄 050000；3.湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079）

国内已有大量文献报道，沙棘籽油具有增强免疫力、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗癌、保护心脑血管系统、抗炎生肌、抗溃疡、保肝、抗衰老等广泛保健药理作用［1，2，3］，而沙棘果油的活性作用报道较少。沙棘果油是从沙棘果肉和果汁中提出的油液。据国外报道，沙棘果肉比其种籽中的活性成分多近三分之二，故沙棘果油中含有的活性成分也较籽油中多。沙棘果油的稳定性比籽油好，沙棘果油密封在常温也可保存10年以上，而其种籽油只能保存1～2年［4，5］。本项目旨在研究沙棘果油对小鼠免疫调节作用，将其研制成增强免疫力软胶囊保健食品，其结果报告如下：

1 研究材料

1.1 实验动物

SPF级昆明种雌性小鼠，18～22g，由湖北省预防医学科学院实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK （鄂）2003－0005；实验动物使用许可证号：SYXK （鄂）2003－0014。动物饲养室温度为24℃～26℃，湿度为60%～80%。

1.2 样品来源及处理

软胶囊内容物为棕红色油状液体，来源于河北神兴沙棘研究院，人体推荐日摄入量为3.0g/人/天。将胶囊内容物用单甘脂配制成所需浓度的混悬液，供以下试验用。

剂量分组：按人体推荐日摄入量0.05g/kg.BW扩大10、20、30倍设置低、中、高3个剂量组，即0.5、1.0、1.5g/kg.BW，共分4个实验组，每实验组包括空白对照组和溶剂对照组、低、中、高剂量组，各剂量组实验动物数为10只。免疫实验一组进行迟发型变态反应和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫实验二组进行淋巴器官/体重比值测定和碳粒廓清实验。免疫实验三组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验；免疫实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测。小鼠连续灌胃30d后开始试验。各实验组均按0.20ml/10g.BW容量经口灌胃给予。

2 试验方法和结果

2.1 方法

2.1.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μL COnA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不合小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT （5mg/mL）50μg/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，（100μg/孔）用酶标仪以570nm波长测定光密度值。

2.1.2 二硝基氟苯（DNFB）诱导迟发型变态反应（DTH）

耳肿胀法。用1%DNFB（以1：1的丙酮麻油溶液配制）致敏小鼠后，第5d再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。

2.1.3 血清溶血素的测定

血淋法。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2% （v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5% （v/v）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。

2.1.4 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

半体内法。制备20%的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa－磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：

2.1.5 小鼠碳廓清试验

按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁（100mL/kg），待墨汁注入，立即计时。

注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。

将小鼠处死。取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组，可判定该项实验结果阳性。

2.1.6 抗体生成细胞检测

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，每只鼠经腹腔注射2% （v/v）SRBC 0.2mL。

将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心（1000/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。

空斑的测定：将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量 pH7.2～7.4、2 倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL10%SRBC （v/v，用SA缓冲液配制），20μL 脾细胞悬液（5x106个/mL），迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1∶8）加入玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。