脑胶质瘤细胞SHG44与U87-MG辐射敏感性差异及其机制初步研究

孙志强

（常州市第二人民医院放疗科，江苏 常州 213000）

脑胶质瘤属胶质细胞源性的良、恶性中枢神经系统肿瘤，其中恶性胶质母细胞瘤是成人原发性脑肿瘤中最普遍的亚型[1]，因为大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，所以治疗十分困难。放射治疗是最有效的辅助治疗，但胶质瘤为中等放射敏感度，如何增加肿瘤组织的辐射敏感性，减轻正常组织损伤，以提高治疗效果，是我们的目的所在。环氧化酶2（Cyclooxygenase，COX-2）在许多恶性肿瘤中呈高表达，与局部浸润、远处转移及预后等关系密切[2]。许多研究发现COX-2抑制剂在体外和动物实验中均有抗肿瘤与放射增敏作用，但其具体作用机制目前尚不清楚[3-5]。本实验通过克隆法、反转录聚合酶链反应（Reverse transcriptase PCR，RT-PCR）法检测60Co-γ射线照射两种胶质瘤细胞SHG44与U87-MG克隆存活率及COX-2 mRNA表达水平的关系，探讨胶质瘤细胞辐射敏感性差异的可能机制，为寻求增强放射敏感性药物提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

脑胶质瘤细胞SHG44及细胞U87-MG，由苏州大学肿瘤放射生物研究室提供；RPMI 1640培养基（Gibco）；胎牛血清购（四季青）；RNeasy Mini Kit，QIAshredder Homogenizers（QIAGEN）；Rtase M-MLV/RTase Hˉ，Random primers（Takara）；COX-2引物、18S rRNA引物（生工）。

1.2 方法

1.2.1 辐照条件

60Co-γ射线（剂量率1Gy/min，源距2.8m）辐照。

1.2.2 克隆法检测细胞存活率

以对数生长期细胞制备单细胞悬液，接种24h后细胞贴壁，给予不同剂量60Co-γ射线照射，照射后胰酶消化制备单细胞悬液，以500个细胞/皿接种至60mm培养皿，培养11～12d后甲醇固定、Gimsa染色后，显微镜下计数50个细胞以上的细胞集落。每组每个剂量点设三个平行样。计算各种实验条件下的克隆形成率。应用Graphpad prism 5 Demo 软件，以单击多靶模型S= 1 - （1 - e - D/ Do） N，拟合细胞存活曲线，测定、计算Do、Dq和SF2等多个放射生物学参数。独立性实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR法测定COX-2 mRNA的表达水平

对数生长期的SHG44细胞和U87-MG接种24h后，胰蛋白酶消化，收集细胞。RNeasy Mini Kit提取细胞总mRNA。总RNA先逆转录反应合成第一链。取1μL逆转录反应产物进行PCR扩增，COX-2上游引物为5’-TGAAACCCACTCCAAACACA-3’，下游引物 3’-AACTGATGC GTGAAGTGCTG-5’，18S rRN下游引物5’-GTAACCCGTTGAACCC CATT-3’，下游引物3’-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-5’。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增25个循环PCR产物经3%琼脂糖凝胶水平电泳分离，并与DNA分子量Marker进行比较，Bandscan5.0图像分析软件行半定量分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 克隆法测定60Co-γ线照射对SHG44和U87-MG细胞存活率的影响

随着照射剂量的增加，细胞渐失去分裂增生的能力，在10 Gy组仅有极少数细胞能形成克隆。图1不同照射剂量下SHG44和U87-MG细胞的存活曲线；两种细胞的存活分数随着照射剂量的增高而下降，属于单击多靶模型。

表1为采用单击多靶模型拟合后获得的多个放射生物学参数：平均致死剂量D0，细胞受损所需准阈剂量Dq，2Gy时细胞存活分数SF2。

由表1可见，U87-MG细胞的D0、Dq、SF2值均较SHG44细胞的值小，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR测定SHG44、U87-MG细胞COX-2 mRNA表达水平，见图2和表2。

图1 60Co-γ线照射后SHG44和U87-MG细胞克隆形成率

表1 SHG44和U87-MG细胞放射增敏参数（±s，n＝3）

与SHG44细胞相比，*P＜0.05

细胞组别 D0 Dq SF2 SHG44 3.18±0.21 2.63±0.11 0.83±0.03 U87-MG 3.07±0.17* 1.86±0.09* 0.74±0.02*

图2 SHG44和U87-MG细胞COX-2 mRNA与18S rRNA表达

图2示，SHG44和U87-MG细胞组COX-2 mRNA与18S rRNA泳道上可见一大小与引物设计理论值相符的特异性扩增条带。以18S rRNA灰度定为1，COX-2 mRNA 相对表达量=COX-2 cDNA/18S rRNA cDNA。

表2 SHG44细胞COX-2 mRNA相对表达水平

表2中，U87-MG细胞COX-2 mRNA相对表达水平较SHG44细胞高，其差异具有显著性 （P＜0.01）。

3 讨 论

环氧化酶（cyclooxygenase，COX）是参与花生四烯酸转化为各种内源性前列腺素（PGs）过程中重要的限速酶，参与机体的多种病理生理过程。其中COX-2是一种诱导型酶。近年来研究显示，COX-2在一些肿瘤中存在过度表达现象，提示COX-2可能与肿瘤的发生、发展密切相关[6]。国外相关研究表明放疗中射线是刺激COX-2表达的一种因素，能增强细胞内COX-2的表达水平，并随具有剂量效应[7]。

从细胞存活曲线图发现，两种胶质瘤细胞的存活分数随辐射剂量的增高呈指数性降低，细胞的剂量-存活曲线符合单击多靶模型。放射生物学参数中，D0是存活率下降63%所需剂量，D0越小，放射敏感性越强；Dq代表细胞累积亚致死性损伤的能力，Dq减小，放射敏感性增强；SF2是代表细胞放射敏感性的重要指标，SF2越大，放射抗拒性越强。U87-MG细胞的D0、Dq、SF2值均小于SHG44细胞，其差异具有显著性（P＜0.05），表明U87-MG细胞的辐射敏感性大于SHG44细胞。本实验中，检测了两种胶质瘤细胞SHG44与U87-MG 的COX-2 mRNA表达水平，发现U87-MG细胞的COX-2 mRNA相对表达水平高于SHG44细胞，其差异具有显著性（P＜0.01）。Pyo H等[8]用COX-2选择性抑制剂NS-398处理人NCI-H460肺癌移植瘤裸鼠时发现，NS-398的辐射增敏作用与细胞表达COX-2的能力相关。NS-398联合辐射可显著抑制高表达COX-2的NCI-H460肺癌移植瘤的生长。Amirghahari[9]等认为COX-2选择性抑制剂通过COX-2蛋白依赖机制增强细胞的辐射敏感性。由此我们推测胶质瘤细胞的辐射敏感性与其COX-2 mRNA表达水平密切相关，这些实验结果为放疗过程中应用靶向调节COX-2 水平的药物提供重要的参考。

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