高效液相色谱法测定金七丽搽剂中的秋水仙碱和大黄素的含量

汤秀梅,刘 波,朱兆云,王京昆,字 刚

(云南省药物研究所,云南 昆明 650111)

金七丽搽剂为云南省药物研究所申报的中药六类新药项目,该复方制剂由丽江山慈菇、大黄等多味药材组成,具有消肿止痛的功效,用于痛风性关节炎治疗。针对痛风的主要症状,选用云南的地道药材制成复方外用制剂,该复方具有较好的民间使用基础,对痛风性关节痛有独到的效果;选用高效液相色谱法测定秋水仙碱,大黄素含量,建立了定量的质控方法,并对测定方法进行验证研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国 Agilent 1100高效液相色谱仪,电子天平(Mettler AE163,Mettler Toledo AB204-S),HS6150D超声清洗仪,HH-6数显恒温水浴锅。

1.2 试药 流动相为色谱纯,其它试剂和试药均为分析纯。实验三批制剂为云南省药物研究所制剂中心制备。大黄素对照品,批号:110756-200110,供含量测定,购于中国药品生物制品检定所;秋水仙碱对照品,批号:2005985,用于 HPLC,购于Fluka。

2 方法与结果

2.1 秋水仙碱含量测定[1～4]

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Gemine 5 u C18110A(5μ m,Φ 4.6×250 mm);流动相:水–乙腈体积比(18∶82),流速 1.0 mL/min,检测波长为 245 nm;进样量 10 μ L。

2.1.2 对照品溶液的制备 取秋水仙碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含 48μg的溶液,即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取供试品15 g,每次用二氯甲烷15 mL,分别萃取5次,合并萃取液挥干,甲醇定容到25 mL的容量瓶中,即得。

2.1.4 阴性溶液的制备 精密称取无丽江山慈菇样品15 g,每次用二氯甲烷15 mL,分别萃取5次,合并萃取液挥干,甲醇定容到25 mL的容量瓶中,即得。

2.1.5 系统适用性实验 按样品含量测定项下的色谱条件,分别取对照品溶液、供试品溶液,以及丽江山慈菇的阴性样品溶液10 μ L分别进样分析。色谱图如图所示,被测组分分离效果较好,所用溶剂对检测结果无影响,理论塔板数不低于6000。

图1 专属性试验色谱图

2.1.6 线性试验 精密称取秋水仙碱对照品26.36 mg,置10 mL量瓶中,加适量甲醇溶解,定容至刻度,摇匀,作为母液备用。分取 1.0 mL 置 2、5、25、50、100、250 mL 量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,再取 25 mL容量瓶中的 1 mL定容至25 mL,用 0.45 μ m滤膜过滤作为对照品溶液,按上述方法各进样 10 μ L,检测,以浓度(mg/mL)为横坐标,面积为纵坐标,得回归方程:Y=33765X-88.741,R=1;结果表明秋水仙碱在 0.04218～13.18μ g范围内该方法线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 取配制好的对照品溶液,连续进样6针,以峰面积计算,结果秋水仙碱峰的RSD为0.92%。

2.1.8 重复性试验 称取同一批供试品,按照制备方法同时制成 6份供试品溶液,进样 10 μ L,测定。测定结果的 RSD为1.30%。

2.1.9 中间精密度试验 不同人员称取同一批供试品,按照制备方法分别制成3份供试品溶液,进样10 μ L,测定。测定结果的RSD为1.08%。

2.1.10 范围 取同一批样品,按供试品取样量的50%、100%、200%分别称取,制备测定大黄素含量,测定结果表明,测试方法取样量的浓度50%～200%,RSD为 1.32%达到要求。

2.1.11 稳定性试验 取已配制好的供试品溶液依法测定,分别于 0、1、3、6、12、18、24 h 进样,以峰面积计算,结果 RSD为1.91%,所得的样品中秋水仙碱峰面积基本一致,说明样品在24 h内基本稳定。

2.1.12 加样回收率试验 取9份供试品(测含量为3.7714×10-3%),精密称定,分置已编号为 1至9的25 mL量瓶中,在 1、2、3号锥形瓶中分别加入浓度为0.3618 mg/mL的秋水仙碱对照品溶液各1 mL,在4、5、6号锥形瓶中分别加入浓度为0.3618 mg/mL的秋水仙碱对照品溶液各2 mL,在7、8、9号锥形瓶中分别加入浓度为 0.3618 mg/mL的秋水仙碱对照品溶液各3 mL,然后按供试品制备方法同法处理,依法测定,计算回收率,结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.1.13 样品含量测定 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部(附录ⅥD))测定。依法操作,测定3批样品,结果见表2。

表2 3批样品含量测定结果

根据3批样品的测定结果,在测定值的基础上,低值向下浮动 20%,即 44.2μg/g×80%=35.36μg/g,高值向上浮动20%,95.0×120%=114μg/g,将本品的含量限度定为:本品每1 g中含秋水仙碱应为30～120μg。

2.2 大黄素含量测定[5～7]

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Gemine 5u C18110A(5 μ m,Φ 4.6×250 mm);以甲醇-0.1%磷酸溶液体积比(70∶30)为流动相;检测波长为254 nm;进样量10 μ L。

2.2.2 对照品溶液的制备 取大黄素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液,即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取供试品12.5 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取无大黄的样品12.5 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得。

2.2.5 系统适用性 按样品含量测定项下的色谱条件,分别取对照品溶液、供试品溶液,以及大黄的阴性样品溶液10 μ L分别进样分析。色谱图如图2所示,被测组分分离效果较好,所用溶剂对检测结果无影响,理论塔板数不低于4500。

图2 专属性试验色谱图

2.2.6 线性试验 精密称取大黄素对照品12.57 mg,置25 mL量瓶中,加适量甲醇溶解后定容至刻度,摇匀,作为母液备用。精密量取 1.0 mL 置 2、5、10、50、100 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,用 0.45 μ m 滤膜过滤,按上述方法分别进样 10 μ L,结果以浓度(mg/mL)为横坐标,面积为纵坐标,得回归方程:Y=28022x-7.4194,R=0.9997;以上结果表明该方法在 0.05028～5.028μg范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 取配制好的对照品溶液按照含量测定方法依法测定,连续进样6针,以峰面积计算,结果大黄素的RSD为0.22%(n=6)。

2.2.8 重复性试验 称取同一批供试品,按照制备方法同时制成6份供试品溶液,进样10 μ L,测定。以峰面积计算含量,测定结果的RSD为1.24%(n=6)。

2.2.9 中间精密度试验 不同人员称取同一批供试品,按照制备方法分别制成 3份供试品溶液,进样 10 μL,测定。测定结果的RSD为1.98%。

2.2.10 范围 取同一批样品,按供试品取样量的50%、100%、200%分别称取,制备测定大黄素含量,测定结果表明,测试方法取样量的浓度50%～200%,RSD为 0.97%达到要求。

2.2.11 稳定性试验 称取已配制好的供试品溶液按照含量测定方法依法测定,分别于 0、1、2、5、11、17、24 h 进样,进样体积10 μ L,结果 RSD为1.26%(n=7),说明样品在 24 h内基本稳定。

2.2.12 加样回收率试验 取9份供试品(测含量为1.0059%×10-2%),精密称定,分置已编号为1至9的25 mL量瓶中,在1、2、3号锥形瓶中分别加入浓度为0.5224 mg/mL的大黄素对照品溶液各1 mL,在 4、5、6号锥形瓶中分别加入浓度为0.5224 mg/mL的大黄素对照品溶液各2 mL,在7、8、9号锥形瓶中分别加入浓度为0.5224 mg/mL的大黄素对照品溶液各3 mL,然后按供试品制备方法同法制备,进样测定,计算回收率,结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.2.13 样品含量测定 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部(附录ⅥD))测定。依法操作,测定3批中试样品,结果见表4。

表4 3批中试样品含量测定结果

根据3批样品测定结果,在此均值105.3%的基础上向下浮动 20%,即 105.3μg/g ×80%=73.7μg/g,故取不低于70μg/g作为本品大黄素的含量限度。

3 讨论

金七丽搽剂处方中丽江山慈菇为主药,含秋水仙碱,秋水仙碱是针对急性痛风性关节炎有效的抗炎剂,对痛风急性发作有特别显著的治疗效果,也是有效的预防药。秋水仙碱是丽江山慈菇药材中治疗痛风的有效成分,在含量测定中选用秋水仙碱为指示物;大黄药材的现代药理研究显示,大黄素为大黄药材的活性成分,在不同代谢系统方面都具有明显的药理活性,在制剂的含量测定研究中,选用大黄素作为指标物。

选择秋水仙碱含量测定的流动相,根据文献资料,试验了0.05 mol/L磷酸二氢钾与甲醇不同比例的流动相,出峰较集中在前面,几乎找不到秋水仙碱峰;试验0.1%磷酸溶液与乙腈的不同比例流动相,可以得到秋水仙碱峰分离效果较好,出峰时间在35 min,考虑到酸液对柱子的损害较大,试用水代替0.1%磷酸溶液,结果不断调整流动相比例,得到乙腈–水(18∶82),分离度为1.5左右。

在确定秋水仙碱、大黄素含量测定的方法,验证耐用性试验。分别试验色谱柱:Waters-synnery,Thermo Bds hypersil C18,Phenomenex Gemine 5u C18110A;流速:1.2 mL/min,1.0 mL/min,0.8 mL/min,;柱温:10℃、20℃、30℃。结果表明3种柱子,3种流速,3种柱温在相同的色谱条件下,分离度在1.5以上。

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